인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출
Summary
RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.
Abstract
레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3′ 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.
Introduction
안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.
ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법은 유전자 특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 오른쪽 극성의 상보성 DNAs(cDNAs)를 합성합니다. 그러나 이러한 접근법은 초기 RNA 템플릿의 배향(감각 또는 안티센스)을 결정하는 것을 허용하지 않으며, RNA 헤어핀 또는 루프가프라이머(10)가없는 상태에서 양방향으로 RT를 프라임할 수 있기 때문에, RT 자체 프라이밍으로 알려진 현상이다. 대부분의 ASP 조사자들은 HIV-111,12와관련이 없는 시퀀스로 태그가 지정된 프라이머를 사용하여 RT 자체 프라이밍의 문제를 회피한다. 그러나 이러한 전략은 현상의 발생을 제거하지 않으며, 비특이적 cDNA를 PCR11로잠재적으로 이월시킬 수 있다.
우리는 최근에 안티센스 RNA의 연구 를 위한 새로운 가닥 특이적 RT-PCR 분석기를 개발하고 우리는 표 1에도시된 바와 같이 6명의 HIV 감염한 환자의 코호트에서 ASP RNA 검출을 위해 그것을 이용했습니다. 아래에 설명된 절차는 이전에 안토니오 만카렐라 외13에의해 출판되었습니다. 프로토콜에서는 이중 접근 방식으로 비특정 cDNA의 생산을 방지합니다. 첫째, 우리는 고온 (94 °C)에서 RNA를 분해하여 RNA 이차 구조를 제거하고, 둘째, 우리는 생체 별 ASP 특이적 프라이머를 사용하여 ASP RNA를 역전시키고 결과 cDNA를 정화합니다. 이 접근법에 의해, 우리는 다른 비특이적 RT 제품이 생성되는 것을 방지하거나 (RNA의 고온 변성) 또는 PCR (선호도 정제) 이전에 제거되기 때문에 우리의 목표 cDNA만 증폭할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 ‘끝에서 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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