Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

Summary

Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Abstract

Dans les rétrovirus, la transcription d'antisense a été décrite dans le type 1 de virus d'immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l'env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l'orientation, la fin de 3' du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L'étude de l'ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d'ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l'absence de l'amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L'utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d'affinité de l'ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d'amplifier sélectivement l'ARN d'ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l'étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d'autres systèmes biologiques.

Introduction

Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp41¹. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Bien que les transcriptions anti....

Protocol

Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par souche_HXB2 VIH-1

1. Jour 1: PBMCs STIMULATION
   1. Isoler les PBMC d'un pelage velauve de donneur sain.
   2. Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1x10⁶/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (R-10), avec l'ajout de 50 U/mL d'interleukine-2 (IL-2) et de 3 g/mL ph....

Results

La dénaturation à haute température de l'ARN couplée à la purification d'affinité de l'ADNc biotinylated empêche l'amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens^10,14,15,16,

Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l'ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L'occurrence de l'amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d'ARN avec la polarité droite, menant à l'interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d'ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le marquage de l'amorce inverse.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Kit de séquençage de cycle	Biosystème appliqué, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ Lymphocyte T Kit d’isolement	Stemcell Technologies	19052
Sérum bovin fœtal	Biowest	S1010-500
Kit de solution de fixation/perméabilisation	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 anticorps de cytométrie en flux - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectine de Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes jaunes fixables, pour excitation à 405 nm	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Souris anti-humaine CD28	Becton Dickinson	55725
Souris anti-humaine CD3	Becton Dickinson	55329
Amorces et sondes	ADN intégré Technologies (IDT)
Pénicilline-Streptomycine	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq ADN polymérase Haute Fidélité	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Réactif	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master	Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific
Kit de clonage TOPO TA pour le sous-clonage, avec des cellules E. coli chimiquement compétentes One Shot TOP10	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µ ; L)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermocycleur	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786