Påvisning av humant immunsvikt virus type 1 (HIV-1) Antisens protein (ASP) RNA transkripsjoner hos pasienter med strand-spesifikk RT-PCR
Summary
RNA-pinner og-løkker kan fungere som primere for omvendt transkripsjon (RT) i fravær av sekvens spesifikke primere, forstyrrer studiet av overlappende antisens transkripsjoner. Vi har utviklet en teknikk som er i stand til å identifisere strand-spesifikke RNA, og vi har brukt det til å studere HIV-1 antisens protein ASP.
Abstract
I retroviruses, antisens transkripsjon er beskrevet i både humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) og Human T-lymfotropt virus 1 (HTLV-1). I HIV-1, antisens protein ASP genet er plassert på den negative strand av env, i lesing ramme-2, som spenner over krysset gp120/gp41. I den forstand orientering, den 3 ‘ slutten av ASP åpne lese rammen overlapper med gp120 hypervariable regioner v4 og v5. Studiet av ASP RNA har blitt forhindret av et fenomen som kalles RT-Self-priming, der RNA sekundære strukturer har evnen til å prime RT i fravær av den spesifikke primer, genererer ikke-spesifikke cDNAs. Den kombinerte bruken av høy RNA-denaturering med biotinylated omvendt grunning i RT-reaksjonen, sammen med affinitet rensing av cDNA på streptavidin magnetiske perler, har gjort det mulig for oss å selektivt forsterke ASP RNA i CD4 + T-celler avledet fra personer som er smittet med HIV-1. Vår metode er relativt lave kostnader, enkel å utføre, svært pålitelig, og lett reproduserbar. I denne sammenheng representerer det et kraftig verktøy for studiet av antisens transkripsjon ikke bare i HIV-1, men også i andre biologiske systemer.
Introduction
Den antisens protein (ASP) genet er en åpen lese ramme (ORF) ligger på den negative tråden av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) konvolutt (env) gen, som spenner over krysset gp120/gp411. I løpet av de siste 30 årene har flere rapporter vist at HIV-genet faktisk skrives ut og oversettes med2,3,4,5,6,7,8,9. Selv om ASP-antisens transkripsjoner har blitt fullt ut karakterisert in vitro, inntil nylig informasjon om den faktiske PRODUKSJONEN av ASP RNA hos pasienter manglet fortsatt.
Sekvensen av ASP er omvendt og komplementære til env. Dette representerer en stor hindring når du prøver å oppdage transkripsjoner for ASP. Standard omvendt transkripsjon-polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) metoder bruker gen-spesifikke antisens primere å syntetisere komplementære DNAs (cDNAs) av høyre polaritet. Denne tilnærmingen, men tillater ikke å bestemme retningen (følelse eller antisens) av den første RNA-malen, siden RNA-pinner eller løkker kan Prime RT i begge retninger i fravær av primer10, et fenomen kjent som RT selv-grunning. De fleste ASP etterforskere omgå problemet med RT selv-grunning ved hjelp av primere merket med sekvenser som ikke er relatert til HIV-111,12. Denne strategien eliminerer imidlertid ikke forekomsten av fenomenet, og kan føre til potensiell bæring av ikke-spesifikke cDNAs i PCR-11.
Vi har nylig utviklet en roman tråd-spesifikk RT-PCR-analyse for studiet av antisens RNA, og vi har brukt den til ASP RNA-deteksjon i en kohort av seks HIV-infiserte pasienter, som vist i tabell 1. Prosedyren beskrevet nedenfor har tidligere blitt utgitt av Antonio Mancarella et al.13. I vår protokoll unngår vi produksjon av ikke-spesifikke cDNAs med en dobbel tilnærming. For det første eliminerer vi RNA sekundære strukturer ved denaturering RNA ved høy temperatur (94 ° c), og for det andre reverserer vi transkribere ASP RNA ved hjelp av en biotinylated ASP-spesifikk primer og affinitet-renser den resulterende cDNA. Ved denne tilnærmingen er vi i stand til å forsterke bare våre mål cDNA, siden andre ikke-spesifikke RT produkter er enten forhindret fra å bli generert (høy temperatur denaturering av RNA) eller eliminert før PCR (affinitet rensing).
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten beskriver vi en tråd-spesifikke RT analysen brukes til påvisning av ASP RNA i CD4 + T celler isolert fra personer smittet med HIV-1. Forekomsten av ikke-spesifikk priming under RT hemmer påvisning av RNA transkripsjoner med høyre polaritet, som fører til feil tolkning av resultatene. Tidligere grupper har utviklet flere strategier rettet mot å forebygge primer-uavhengig cDNA syntese under RT reaksjonen. Merking omvendt primer på 3 ‘ end med sekvenser som ikke er relatert til HIV har vist seg effe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick, og Matthieu Perreau for alltid å være tilgjengelig for å diskutere vårt arbeid og alle menneskene i laboratorium for AIDS Immunopathogenesis for deres dyrebare teknisk assistanse. Vi ønsker også å takke John og Aaron Weddle fra VSB Associated Inc. som bidro med gode kunstverk. Til slutt, mange spesiell takk til alle pasientene, uten hvem dette arbeidet ikke ville vært mulig. Dette arbeidet fikk ingen spesifikk bevilgning fra noen finansierings organ.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
