Registrazione elettrofisiologica wireless dei neuroni da tetrodi mobili in pesci che nuotano liberamente
Summary
Viene presentata una nuova tecnica wireless per la registrazione di segnali neurali extracellulari dal cervello di pesci rossi che nuotano liberamente. Il dispositivo di registrazione è composto da due tetrodi, un microdrive, un registratore di dati neurali e una custodia impermeabile. Tutte le parti sono personalizzate, ad eccezione del data logger e del relativo connettore.
Abstract
I meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per lo più sconosciuti, anche se i pesci costituiscono la maggior parte di tutti i vertebrati. La capacità di registrare l’attività cerebrale dei pesci liberamente in movimento farebbe progredire notevolmente la ricerca sulla base neurale del comportamento dei pesci. Inoltre, un controllo preciso della posizione di registrazione nel cervello è fondamentale per studiare l’attività neurale coordinata tra le regioni del cervello dei pesci. Qui, presentiamo una tecnica che registra in modalità wireless dal cervello di pesci che nuotano liberamente mentre controlla per la profondità della posizione di registrazione. Il sistema si basa su un registratore neurale associato a un nuovo impianto compatibile con l’acqua in grado di regolare la posizione di registrazione mediante tetrodi controllati da microdrive. Le capacità del sistema sono illustrate attraverso registrazioni dal telencephalon del pesce rosso.
Introduction
I pesci sono il più grande e diversificato gruppo di vertebrati, e come altri vertebrati presentano capacità cognitive complesse come la navigazione, socializzare, dormire, caccia, ecc. Tuttavia, i meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per la maggior parte sconosciuti.
Negli ultimi decenni, le registrazioni extracellulari da pesci immobilizzati sono state implementate principalmente per studiare diversi aspetti della base neurale del comportamento1,2. Anche se questa tecnica è appropriata per alcuni sistemi sensoriali, l’indagine dell’intero spettro della base neurale del comportamento è difficile se non impossibile negli animali immobilizzati. I primi progressi hanno riguardato la registrazione dalle cellule Mauthner del pesce da nuoto legato3,4. Tuttavia, le cellule Mauthner sono sproporzionatamente grandi e l’azione registrata potenziale ampiezza, che può andare alto come pochi mV, facilitare la registrazione. Più tardi, Canfield ealtri descrissero una prova di concetto quando si usaun animale legato per registrare dal telecefalo dei pesci5. Un’altra tecnica recente per la registrazione dell’attività neurale dai pesci è l’imaging del calcio (vedi recensioni di Orger e de Polavieja6e Vanwalleghem et al.7). Questa tecnica è stata sviluppata per l’uso con larve di pesce zebra perché la pelle e il cranio sono trasparenti durante lo stadio larvale. Tuttavia, questa tecnica non può essere utilizzata per studiare comportamenti complessi nelle fasi successive dello sviluppo.
Qui, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione dell’attività neurale extracellulare dal cervello dei pesci che nuotano liberamente. Questa è una versione modificata del protocollo descritto in Vinepinsky et al.8. L’innovazione principale è l’aggiunta di un microdrive che permette di controllare la posizione degli elettrodi dopo l’intervento chirurgico. La tecnica è progettata per la registrazione dal telencephalon dei pesci rossi utilizzando una serie di tetrodi che sono collegati a un registratore di dati neurali tramite un microdrive. L’intera configurazione è wireless e ancorata al cranio del pesce. Il peso specifico del sistema è equalizzato al peso specifico dell’acqua aggiungendo un piccolo galleggiante che permette al pesce di nuotare liberamente.
La tecnica si basa sull’uso di un data logger neurale che amplifica, digitalizza e memorizza il segnale in un dispositivo di memoria di bordo. Il sistema di telemetria del logger viene utilizzato per avviare e arrestare le registrazioni e per la sincronizzazione con la videocamera. In questo protocollo, viene utilizzato un logger neurale a 16 canali, incorporato in una scatola impermeabile insieme al microdrive.
L’assieme del micromotore è fabbricato da due componenti principali: il micromotore stesso e l’alloggiamento del micromotore (Figura 1A,B). L’alloggiamento contiene il microdrive e i tetrodi, e funge anche da ancora tra il cranio e la scatola del logger (Figura 1C). La scatola del logger di PVC viene fabbricata utilizzando un processo macchina ed è sigillata utilizzando un anello O(Figura 1E-G, vedere anche Figura supplementare 1, Figura supplementare 2e Figura supplementare 3 per un diagramma tridimensionale [3D]). Ad un’estremità, un pezzo di schiuma di polistirolo è attaccato alla scatola del logger per compensare il peso dell’impianto e fornire al pesce un impianto neutro di galleggiamento. La costruzione del microtrasporto descritto nel protocollo segue la procedura presentata da Vandecasteele et al.9 con una modifica per collegare il microtrasporto all’alloggiamento (Figura 1A). Vengono presentati tutti i passaggi principali.
La procedura descritta nel protocollo per preparare il teschio di pesce è simile a quella presentata in Vinepinsky et al.8 ed è descritta brevemente nel protocollo. Un giorno dopo l’intervento chirurgico, i pesci sono normalmente completamente recuperati dagli effetti dell’anestesia e sono pronti per gli esperimenti comportamentali. Si noti che la posizione del tetrode può essere regolata ruotando la vite del microdrive. La vite ha una spaziatura di 300 m per rotazione completa e si raccomanda un avanzamento di 75 m fino a raggiungere la posizione del cervello di destinazione. Un atlante cerebrale appropriato dovrebbe essere consultato per indirizzare la regione cerebrale specifica di interesse. Si consiglia di testare l’impedimento elettrodo ogni volta che il pesce viene anetizzato per la sostituzione della batteria o della scheda di memoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi necessarie per impiantare una serie di tetrodi nel telencephalon di pesci rossi che nuotano liberamente. Questa tecnica implementa un logger neurale che amplifica e registra i segnali acquisiti da un massimo di 16 canali insieme a un microdrive che può regolare la posizione tetrode nel cervello. Il microdrive permette di regolare la posizione nel cervello per ottimizzare la registrazione.
Questo protocollo può essere facilmente modificato per l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Nachum Ulanovsky e ai membri del laboratorio di Ulanovsky per tutto il loro aiuto. Inoltre, siamo grati a Tal Novoplansky-Tzur per l’assistenza tecnica disponibile. Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario di THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION – FIRST (grant no. 281/15), e del Helmsley Charitable Trust attraverso l’Iniziativa di Robotica Agricola, Biologica e Cognitiva dell’Università Ben-Gurion del Negev.
Materials
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15-blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1X3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1X3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2X6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement – GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 minutes curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
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