लिम्फ नोड क्रायोसेक्शन में ट्यूमर सेल आसंजन का परिमाणीकरण
Summary
यहां, हम एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन करते हैं जो चिपकने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के मात्राकोलिम्स को लिम्फ नोड (एलएन) क्रायोसेक्शन की अनुमति देता है। एलएन-अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित विधि द्वारा पुष्टि की जाती है, जिससे एक आसंजन सूचकांक होता है जो एलएन पैरान्चिमा को ट्यूमर सेल-बाध्यकारी आत्मीयता का पता चलता है।
Abstract
ट्यूमर-ड्रेन लिम्फ नोड्स (एलएनएस) केवल ट्यूमर-उत्पादित कचरे के फिल्टर नहीं हैं। वे कैंसर के विभिन्न प्रकार के रोगियों में प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं के अनंतिम निवास के सबसे आम क्षेत्रीय स्थलों में से एक हैं। इन एलएन में रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाना खराब पूर्वानुमान और न्यायनिर्णयन चिकित्सा निर्णयों से जुड़ा एक महत्वपूर्ण बायोमार्कर है। हाल ही में माउस मॉडल संकेत दिया है कि एलएन रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं दूर मेटाटैस के लिए घातक कोशिकाओं का एक बड़ा स्रोत हो सकता है । एलएन पैरान्चिमा के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की चिपकने की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता प्रायोगिक अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण गेज है जो लिम्फेटिक/मेटास्टैटिक प्रसार के लिए प्रासंगिक जीन या सिग्नलिंग रास्तों की पहचान पर केंद्रित है । क्योंकि एलएनएस अनुभाग के विमान के आधार पर ऊतक वर्गों में विभिन्न प्रकार के दिखावे और रचनाओं के साथ जटिल 3 डी संरचनाएं हैं, इसलिए उनके मैट्रिस को पूरी तरह से नियंत्रित तरीके से प्रयोगात्मक रूप से विट्रो में दोहराना मुश्किल होता है। यहां, हम एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन करते हैं जो चिपकने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के मात्राकरण को एलएन क्रायोसेक्शन की अनुमति देता है। एक ही एलएन के धारावाहिक वर्गों का उपयोग करते हुए, हम गैर रेडियोधर्मी लेबल का उपयोग करने के लिए ब्रॉडटी द्वारा विकसित क्लासिक विधि को अनुकूलित करते हैं और सीधे एलएन सतह क्षेत्र में ट्यूमर कोशिकाओं का पालन करने की संख्या को गिनते हैं। एलएन-अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित विधि द्वारा पुष्टि की जाती है, जिससे एक आसंजन सूचकांक दिया जाता है जो एलएन पैरान्चिमा को सेल-बाध्यकारी आत्मीयता का पता चलता है, जो उनके सहसंबंधित एलएन-लिगांड के लिए पूर्णांक के आत्मीयता बाध्यकारी में आणविक परिवर्तन का विचारोत्तेजक सबूत है।
Introduction
कैंसर मेटास्तासिस उपचार विफलता और कैंसर के प्रमुख जीवन के लिए खतरा पहलू के लिए मुख्य कारण है। 130 साल पहले के रूप में, मेटास्टैटिक फैल परिणाम जब प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं (DTCs, “बीज”) के एक अभिजात वर्ग विशिष्ट जैविक क्षमताओं है कि उंहें प्राथमिक साइटों से बचने के लिए और दूर साइटों (“मिट्टी”)1पर घातक विकास की स्थापना की अनुमति प्राप्त करते हैं । हाल ही में, “बीज और मिट्टी” संबंधों के बारे में कई उपन्यास अवधारणाएं उभरी हैं, जैसे प्रीमेटास्टैटिक निकस (बीजों के लिए आवश्यक “उपजाऊ मिट्टी” के रूप में संकल्पित), डीटीसी द्वारा प्राथमिक ट्यूमर की स्व-सीडिंग, माध्यमिक अंगों पर “बीज” निद्रा और मेटास्टैसिस2का समानांतर प्रगति मॉडल।
अधिकांश ठोस घातक ताओं के लिए, डीटीसी कई मेसेनचिमल अंगों में रह सकते हैं और उनका पता लगाया जा सकता है, जैसे कि नैदानिक मेटास्टैसिस के सबूत के साथ या बिना रोगियों में बोन मैरो और लिम्फ नोड्स (एलएनएस)। क्योंकि ट्यूमर-ड्रेनएलडीसी के क्षेत्रीय प्रसार का पहला स्थान है, एलएन स्थिति एक महत्वपूर्ण शकुन संकेतक है और अक्सर न्यायनिर्णयन चिकित्सा निर्णयों से जुड़ा होता है3। कुछ ट्यूमर प्रकारों के लिए, एलएन स्थिति और बदतर परिणामों के बीच संबंध मजबूत है, जिसमें सिर और गर्दन4,5,स्तन6,प्रोस्टेट7,फेफड़े 8,गैस्ट्रिक9,कोलोरेक्टल10,11 और थायराइड कैंसर12शामिल हैं।
एलएनएस लिम्फेटिक सिस्टम के छोटे ओवोइड अंग होते हैं, जो रेटिकुलर कोशिकाओं से ढके होते हैं और लिम्फेटिक जहाजों से घिरे होते हैं। ये अंग प्रतिरक्षा प्रणाली13के कार्यकरण के लिए नितांत आवश्यक हैं . एलएनएस प्रतिरक्षा परिसंचारी कोशिकाओं के लिए आकर्षित प्लेटफार्मों के रूप में कार्य करते हैं, लिम्फोसाइट्स और एंटीजन-पेश कोशिकाओं को एक साथ14लाते हैं। हालांकि, एलएनएस भी परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को आकर्षित करते हैं । दशकों से, एलएनएस मेटास्टैटिक ट्यूमर कोशिकाओं के लिए परिवहन के निष्क्रिय मार्गों के रूप में चित्र थे । हालांकि, हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि ट्यूमर कोशिकाओं को कीमोटैक्टिक (केमोकिन) और/या हैप्टोटैक्टिक (एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स तत्व) लिम्फेटिक एंडोथेलियम15द्वारा स्रावित संकेतों द्वारा एलएनएस की ओर भी निर्देशित किया जा सकता है । उदाहरण के रूप में, ट्यूमर कोशिकाओं में CCR7 रिसेप्टर की अतिअभिव्यक्ति ट्यूमर-ड्रेनएल16 कीओर मेटास्टैटिक मेलानोमा कोशिकाओं के मार्गदर्शन की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, एक्सट्रासेलुलर एलएन प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं17परिसंचारी की भर्ती और अस्तित्व के लिए एक चिपकने वाला पाड़ प्रदान करते हैं । वास्तव में, ट्यूमर-ड्रेनिंग एलएनएस डीटीसी की सीडिंग के लिए उपजाऊ मिट्टी प्रदान करते हैं, जिसे विशिष्ट एलएन माइक्रोएनवायरमेंटल सिग्नल18द्वारा प्रसारात्मक या निष्क्रिय राज्यों में बनाए रखा जा सकता है। इन एलएन में रहने वाले डीटीसी का अंतिम भाग्य विवादास्पद है; कुछ काम ों का सुझाव है कि इन कोशिकाओं मेटास्टैटिक प्रगति19के निष्क्रिय संकेतक हैं, जबकि दूसरों का प्रस्ताव है कि वे प्रतिरोध के अधिक संभावना संस्थापक है (स्वयंबोने प्राथमिक साइटों द्वारा) और/ हाल ही में, प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करके, यह प्रदर्शित किया गया है कि इन एलएन-रहने वाले डीटीसी के एक अंश ने सक्रिय रूप से रक्त वाहिकाओं पर हमला किया, रक्त परिसंचरण में प्रवेश किया औरफेफड़ों को 21उपनिवेश किया।
यह देखते हुए कि एलएनएस में कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति कैंसर आक्रामकता और आक्रामकता के लिए एक मार्कर है, इस अध्ययन में, हमने ब्रॉड22 द्वारा विकसित एक क्लासिक विधि को अनुकूलित किया ताकि वे विट्रो में एलएनएस को ट्यूमर सेल आसंजन को मात्रात्मक रूप से माप सके। फ्लोरेसेंस आधारित परख के उपयोग ने हमें ट्यूमर कोशिकाओं और एलएन क्रायोसेक्शन के बीच चिपकने वाले परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कम लागत, तेजी से, संवेदनशील और पर्यावरण के अनुकूल (गैररेडियोधर्मी) प्रोटोकॉल विकसित करने की अनुमति दी। इस विधि का उदाहरण देने के लिए एनडीआरजी4 जीन अभिव्यक्ति और चूहा एलएन फ्रोजन वर्गों के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करने वाले एमसीएफ-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि इस प्रोटोकॉल ने स्तन कैंसर रोगियों24में देखे गए विट्रो और एलएन मेटास्टेमिस में एलएनएस के लिए ट्यूमर सेल आसंजन के बीच एक अच्छा संबंध की अनुमति दी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर कोशिकाओं के लिम्फेटिक सिस्टम प्रसार के लिए विभिन्न प्रकार की जटिल कोशिका-चालित घटनाओं की आवश्यकता होती है। वे प्राथमिक ट्यूमर से सेल टुकड़ी और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) वास्तुकला के प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ रोसाना डी लीमा पगानो और एना कैरोलिना पिन्हेरो कैम्पोस का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम से अनुदान द्वारा समर्थित था: FAPESP-साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (2016/07463-4) और लुडविग इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च (LICR) ।
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
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