림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화
Summary
여기서, 우리는 림프절 (LN) 저온 절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. LN 부착 종양 세포는 가벼운 현미경 검사법에 의해 용이하게 규각되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 종양 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공합니다.
Abstract
종양 배수 림프절 (LN)은 종양에서 생산된 폐기물의 단순한 필터가 아닙니다. 그(것)들은 암의 다른 모형을 가진 환자에 있는 전파한 종양 세포의 잠정적인 거주의 일반적인 지역 사이트의 한개입니다. 이러한 LN 상주 종양 세포의 검출은 가난한 예후 및 보조 요법 결정과 관련된 중요한 바이오마커이다. 최근 마우스 모델은 LN 상주 종양 세포가 먼 전이에 대한 악성 세포의 실질적인 공급원이 될 수 있음을 나타냈다. LN 실질에 종양 세포의 접수성을 정량화하는 능력은 림프 /전이성 보급과 관련된 유전자 또는 신호 경로의 식별에 초점을 맞춘 실험 연구에서 중요한 게이지입니다. LN은 단면의 평면에 따라 조직 섹션에서 다양한 모양과 조성물을 가진 복잡한 3D 구조이기 때문에, 그들의 행렬은 완전히 통제된 방식으로 시험관 내에서 실험적으로 복제하기 어렵다. 여기서, 우리는 LN 극저온절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 기술한다. 동일한 LN의 직렬 섹션을 사용하여 Brodt가 개발한 고전적인 방법을 적용하여 비방사성 라벨을 사용하고 LN 표면적당 부착 종양 세포의 수를 직접 계산합니다. LN 부착 종양 세포는 광 현미경 검사법에 의해 쉽게 확인되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공하며, 이는 그들의 상관 관계가 있는 LN-ligands에 대한 친화도 결합의 분자 적 변화의 암시적 증거이다.
Introduction
암 전이는 치료 실패와 암의 지배적 인 생명을 위협하는 측면의 주된 이유입니다. 130년 전 가정된 바와 같이, 전이성 확산은 전파된 종양 세포(DTC, “씨앗”)의 엘리트가 1차 부위를 회피하고 먼 부위(“토양”)에서 악성성장을 확립할 수 있는 특정 생물학적 능력을 획득할 때 1. 최근에는 전이성 틈새(“씨앗”이 번성하는 데 필요한 “비옥한 토양”으로 개념화됨), DTC에 의한 1차 종양의 자체 파종, 이차 장기의 “종자” 휴면 및 전이의 병렬 진행 모델과 같은 “종자 및 토양” 관계에 관한 몇 가지 새로운 개념이등장했습니다.
대부분의 고체 악성 종양의 경우, DTC는 임상 전이의 증거가 있거나 없는 환자에서 골수 및 림프절 (LN)과 같은 많은 중간 엽 기관에서 상주하고 검출 될 수 있습니다. 종양 배수 LN은 DTC의 국부적 확산의 첫 번째 위치이기 때문에, LN 상태는 중요한 예후 지표이며 종종 보조 요법 결정과 관련이있다 3. 일부 종양 유형의 경우, LN 상태와 악화 된 결과 사이의 상관 관계는 머리와 목4,5,유방6,전립선7,폐8,위9,대장10,11 및 갑상선 암12를포함합니다.
LN은 망상 세포로 덮여 림프관으로 둘러싸인 림프 계의 작은 난형 기관입니다. 이 기관은 면역 체계 의 기능을 위해 절대적으로 필요합니다13. LN은 면역 순환 세포를 위한 유치플랫폼으로 작용하여 림프구와 항원 제시 세포를함께 14개. 그러나, LN은 또한 순환 종양 세포를 유치합니다. 수십 년 동안, LN은 전이성 종양 세포를 위한 수송의 수동적인 경로로 그림되었습니다. 그러나, 최근 연구는 종양 세포가 또한 화학 전술에 의해 LN을 향해 유도 될 수 있음을 나타냈다 (chemokines) 및 / 또는 haptotactic (세포 외 매트릭스 요소) 림프 내피에 의해 분비 큐15. 일례로, 종양 세포에서 CCR7 수용체의 과발현은 종양 배수 LNs16을향한 전이성 흑색종 세포의 유도를 용이하게 한다. 또한, 세포외 LN 단백질은 순환 종양세포(17)의모집 및 생존을 위한 접착 스캐폴드를 제공한다. 실제로, 종양 배수 LN은 DTC의 시드를 위한 비옥한 토양을 제공하며, 이는 특정 LN 미세 환경신호(18)에의해 증식 또는 휴면 상태에서 유지될 수 있다. 이러한 LN 거주 DTC의 마지막 운명은 논란의 여지가 있습니다. 일부 작품은 이러한 세포가 전이성 진행의 수동 지표임을 제안19,다른 사람은 저항의 가능성이 설립자 제안하는 동안 (자기 파종 기본 사이트에 의해) 및 / 또는 전이에 대한 세포 저장소 역할을 (삼차 암 성장을위한 “씨앗을 확산”20,21. 최근에는 전임상 모델을 이용하여, 이들 LN-상주 DTCs의 일부가 혈관을 적극적으로 침범하고, 혈액순환에 들어가폐(21)를식민지화하는 것으로 입증되었다.
이 연구에서는 LN에서 암세포의 존재가 암 공격성과 침략성에 대한 마커임을 고려하여, 본 연구에서는 Brodt22가 개발한 고전적인 방법을 최적화하여 시험관 내 LN에 대한 종양 세포 접착을 정량적으로 측정했습니다. 형광 기반 분석법의 사용은 우리가 종양 세포와 LN 저온 절 사이의 점착 성 변경의 검출을위한 저렴한 비용, 신속하고 민감하고 환경 친화적 인 (비 방사성) 프로토콜을 개발할 수 있었습니다. MCF-7 유방암 세포를 사용하여 NDRG4 유전자 발현 및 래트 LN 냉동 단면의 상이한 수준을 발현하는 방법을 예시하였고, 이 프로토콜은 유방암 환자24에서관찰된 LN 및 LN 전이에 대한 종양 세포 부착을 양호한 상관관계를 허용한다는 것을 보여주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암세포의 림프계 보급은 다양한 복잡한 세포 구동 이벤트를 필요로 한다. 그(것)들은 1 차적인 종양에서 세포 분리 및 세포외 매트릭스 (ECM) 건축의 개조로 시작하고, 센티넬 LN에 도중에 있는 구심성 림프증을 통해 지속적인 화학요법 및 액티브한 이동에 의해 지원됩니다. 암세포가 NN에서 고착하고 살아남는 경우에, 그(것)들은 그밖 이차 기관에 쉽게 퍼질 수 있습니다. 여기에서 우리는 종양 세포?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
로사나 데 리마 파가노 박사와 아나 캐롤라이나 피네이로 캄포스 박사에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 보조금에 의해 지원되었다: FAPESP – 상파울루 연구 재단 (2016/07463-4) 암 연구를위한 루드비히 연구소 (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Recherche en cancérologie. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Recherche en cancérologie. 66 (10), 5151-5158 (2006).
