Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus
Summary
Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.
Abstract
De aanpassing van planten aan biotische en abiotische spanningen wordt beheerst door een verscheidenheid aan factoren, waaronder de regulering van het stomatale diafragma in reactie op watertekort of ziekteverwekkers een cruciale rol speelt. Het identificeren van kleine moleculen die de stomatale beweging reguleren, kan daarom bijdragen aan het begrijpen van de fysiologische basis waarmee planten zich aanpassen aan hun omgeving. Grootschalige screeningbenaderingen die zijn gebruikt om regelgevers van stomabeweging te identificeren, hebben potentiële beperkingen: sommige zijn sterk afhankelijk van het hormoonsignaleringstraject (ABA) van absciszuur (ABA), waardoor aba-onafhankelijke mechanismen worden uitgesloten, terwijl anderen afhankelijk zijn van de observatie van indirecte, langdurige fysiologische effecten zoals plantengroei en -ontwikkeling. De hier gepresenteerde screeningmethode maakt de grootschalige behandeling van planten met een bibliotheek van chemische stoffen in combinatie met een directe kwantificering van hun transpiratie door thermische beeldvorming mogelijk. Aangezien verdamping van water door transpiratie resulteert in bladoppervlakkoeling, biedt thermische beeldvorming een niet-invasieve benadering om veranderingen in stomalaatgeleiding in de loop van de tijd te onderzoeken. In dit protocol worden Helianthus annuuszaailingen hydroponisch gekweekt en vervolgens behandeld door wortelvoeding, waarbij de primaire wortel wordt gesneden en ondergedompeld in de chemische stof die wordt getest. Thermische beeldvorming gevolgd door statistische analyse van cotyledonaire temperatuurveranderingen in de tijd maakt het mogelijk voor de identificatie van bioactieve moleculen moduleren stomatale diafragma. Onze proof-of-concept experimenten tonen aan dat een chemische stof kan worden uitgevoerd van de snijwortel naar de cotyledon van de zonnebloem zaailing binnen 10 minuten. Bovendien kan, wanneer planten met ABA worden behandeld als een positieve controle, binnen enkele minuten een stijging van de temperatuur van het bladoppervlak worden gedetecteerd. Onze methode maakt het dus mogelijk om nieuwe moleculen die het stomatale diafragma reguleren efficiënt en snel te identificeren.
Introduction
Stresstolerantie bij planten is een polygene eigenschap beïnvloed door een verscheidenheid aan moleculaire, cellulaire, ontwikkelings- en fysiologische kenmerken en mechanismen1. Planten in een fluctuerende omgeving moeten hun stomatale bewegingen voortdurend moduleren om de fotosynthetische vraag naar koolstof in evenwicht te brengen, met behoud van voldoende water en het voorkomen van invasie van ziekteverwekkers2; de mechanismen waarmee deze “beslissingen” worden genomen, zijn echter slecht begrepen3. Invoering van bioactieve moleculen in planten kan moduleren hun fysiologie en helpen bij het indringende nieuwe mechanismen van regulering.
De grootschalige screening van kleine moleculen is een effectieve strategie die wordt gebruikt bij de ontdekking van geneesmiddelen tegen kanker en farmacologische testen om de fysiologische effecten van honderden tot duizenden moleculen in een korte periode van tijd te testen4,5. In de plantenbiologie heeft de screening met hoge doorvoer zijn effectiviteit aangetoond, bijvoorbeeld bij de identificatie van het synthetische molecuul pyrabactine6, evenals de ontdekking van de langgezochte receptor van absciszuur (ABA)7,8. Sindsdien zijn agonisten en antagonisten van ABA-receptoren, en kleine moleculen die in staat zijn om de expressie van ABA-inducible reporter genen te moduleren, geïdentificeerd9,10,11,12,13,14,15. High-throughput screening benaderingen die momenteel beschikbaar zijn om kleine verbindingen die kunnen moduleren stomatale diafragma te identificeren hebben een aantal nadelen: (i) protocollen draaien rond de ABA signalering traject kan voorkomen dat de identificatie van nieuwe ABA-onafhankelijke mechanismen, en (ii) in vivo strategieën die worden gebruikt voor de identificatie van bioactieve kleine moleculen zijn voornamelijk afhankelijk van hun fysiologische effecten op zaadkieming of zaailing groei, en niet op de regulering van plantaardige transpiratie per se.
Bovendien, terwijl er vele manieren om planten te behandelen met bioactieve moleculen, de meeste van hen zijn niet goed geschikt voor een grootschalige studie van stomatale beweging. Kortom, de drie meest voorkomende technieken zijn bladtoepassing door spuiten of dompelen, behandeling van het wortelstelsel, en wortelirrigatie. Bladtoepassing is niet compatibel met de meest voorkomende en snelle methoden om stomatale diafragma te meten, omdat de aanwezigheid van druppels op het bladoppervlak de grootschalige gegevensverzameling verstoort. De belangrijkste beperkingen van wortelirrigatie zijn de grote monstervolumevereisten, het potentieel vasthouden van de verbindingen door elementen in de rhizosfeer en de afhankelijkheid van actieve wortelopname.
Hier presenteren we een grootschalige methode om nieuwe verbindingen te identificeren die de transpiratie van planten reguleren, waarbij niet noodzakelijkerwijs ABA- of bekende droogteresponsieve mechanismen nodig zijn en een efficiënte en betrouwbare behandeling van planten mogelijk maakt. In dit systeem worden Helianthus annuusplanten behandeld met behulp van een wortelvoedingsbenadering die bestaat uit het snijden van de primaire wortel van zaailingen die hydroponisch worden geteeld en het onderdompelen van de snijplaats in de monsteroplossing dompelen. Eenmaal behandeld, wordt het effect van elke verbinding op de transpiratie van planten gemeten met behulp van een infrarood warmtebeeldcamera. Aangezien een belangrijke determinant van bladoppervlaktetemperatuur de snelheid van verdamping van het blad is, kunnen thermische beeldgegevens direct worden gecorreleerd aan stomaalgeleiding. De relatieve verandering in bladtemperatuur na chemische behandeling biedt dus een direct middel om de plantaardige transpiratie te kwantificeren.
H. annuus is een van de vijf grootste oliehoudende gewassen in de wereld16 en ontdekkingen rechtstreeks op deze plant kan vergemakkelijken toekomstige overdracht van technologie. Daarnaast hebben H. annuuszaailingen grote en platte cotyledons, evenals een dikke primaire wortel, die ideaal was voor de ontwikkeling van dit protocol. Deze methode kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere planten en een verscheidenheid aan verbindingen.
Dit protocol kan worden gebruikt om moleculen effectief te identificeren die stomatsluiting kunnen veroorzaken of stomatalopenen kunnen bevorderen, wat grote gevolgen heeft voor het begrijpen van de signalen die de geleiding van stomaen en de aanpassing van planten aan het milieu reguleren Benadrukt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het aantal verbindingen dat op een bepaalde dag kan worden getest, hangt meestal af van (i) de milieugecontroleerde ruimte die beschikbaar is om de planten te laten groeien en het scherm uit te voeren, evenals (ii) het aantal personen dat betrokken kan worden bij stap 6 van het protocol. Wij raden het gebruik van drie experimentele replicaties aan om de interpretatie van de resultaten na statistische behandeling te consolideren. In een typische dag kunnen één tot twee personen zonder problemen 60 verbindingen in drievo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door Pomona College Start-up Fondsen en Hirsch Research Initiatie Grants Fund (aan FJ) evenals de Pomona College Moleculaire Biologie Programma door middel van de Stellar Summer Research Assistant Program (naar KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
