Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus
Summary
Wir bieten eine Methode zur Identifizierung von Modulatoren der Blatttranspiration durch großangelegtes Screening einer zusammengesetzten Bibliothek.
Abstract
Die Anpassung der Pflanzen an biotische und abiotische Belastungen wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, unter denen die Regulierung der stomatalen Öffnung als Reaktion auf Wasserdefizit oder Krankheitserreger eine entscheidende Rolle spielt. Die Identifizierung kleiner Moleküle, die die stomasale Bewegung regulieren, kann daher dazu beitragen, die physiologische Nergrundlage zu verstehen, auf der sich Pflanzen an ihre Umgebung anpassen. Groß angelegte Screening-Ansätze, die zur Identifizierung von Regulatoren der stomatalen Bewegung verwendet wurden, haben potenzielle Einschränkungen: Einige verlassen sich stark auf den Signalweg des Abbscisinsäure(ABA)-Hormons, wodurch ABA-unabhängige Mechanismen ausgeschlossen werden, während andere auf die Beobachtung indirekter, langfristiger physiologischer Effekte wie Pflanzenwachstum und -entwicklung angewiesen sind. Das hier vorgestellte Screening-Verfahren ermöglicht die großflächige Behandlung von Anlagen mit einer Bibliothek von Chemikalien in Verbindung mit einer direkten Quantifizierung ihrer Transpiration durch Wärmebildgebung. Da die Verdunstung von Wasser durch Transpiration zu einer Blattoberflächenkühlung führt, bietet die Wärmebildgebung einen nicht-invasiven Ansatz, um Veränderungen der stomataalen Leitfähigkeit im Laufe der Zeit zu untersuchen. In diesem Protokoll werden Helianthus annuus Sämlinge hydroponisch angebaut und dann durch Wurzelfütterung behandelt, bei der die Primärwurzel geschnitten und in die zu prüfende Chemikalie getaucht wird. Die Wärmebildgebung mit anschließender statistischer Analyse von kotyledonären Temperaturänderungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Identifizierung bioaktiver Moleküle, die die stomamale Öffnung modulieren. Unsere Proof-of-Concept-Experimente zeigen, dass eine Chemikalie innerhalb von 10 Minuten von der geschnittenen Wurzel zum Kotyledon des Sonnenblumensämlings getragen werden kann. Darüber hinaus kann bei der Behandlung von Pflanzen mit ABA als Positivkontrolle innerhalb von Minuten ein Anstieg der Blattoberflächentemperatur festgestellt werden. Unsere Methode ermöglicht somit die effiziente und schnelle Identifizierung neuartiger Moleküle, die die stomatole Öffnung regulieren.
Introduction
Die Stresstoleranz bei Pflanzen ist ein polygener Merkmal, das durch eine Vielzahl molekularer, zellulärer, entwicklungs- und physiologischer Merkmale und Mechanismen beeinflusst wird1. Pflanzen in einer schwankenden Umgebung müssen ihre stomatoalen Bewegungen kontinuierlich modulieren, um den photosynthetischen Kohlenstoffbedarf auszugleichen und gleichzeitig ausreichend Wasser zu erhalten und eine Invasion von Krankheitserregern zu verhindern2; die Mechanismen, mit denen diese “Entscheidungen” zwischen diesen Kompromissen getroffen werden, werden jedoch schlecht verstanden3. Die Einführung bioaktiver Moleküle in Pflanzen kann ihre Physiologie modulieren und bei der Untersuchung neuer Regulationsmechanismen helfen.
Das groß angelegte Screening kleiner Moleküle ist eine effektive Strategie, die bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten und pharmakologischen Assays verwendet wird, um die physiologischen Wirkungen von Hunderten bis Tausenden von Molekülen in kurzer Zeit zu testen4,5. In der Pflanzenbiologie hat das Hochdurchsatz-Screening seine Wirksamkeit beispielsweise bei der Identifizierung des synthetischen Moleküls Pyrabactin6sowie bei der Entdeckung des lang ersehnten Rezeptors von Abscisinsäure (ABA)7,8gezeigt. Seitdem wurden Agonisten und Antagonisten von ABA-Rezeptoren und kleinen Molekülen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von ABA-induzierbaren Reportergenen zu modulieren9,10,11,12,13,14,15. Derzeit verfügbare Hochdurchsatz-Screening-Ansätze zur Identifizierung kleiner Verbindungen, die die stomatole Blendung modulieren können, haben einige Nachteile: (i) Protokolle, die sich um den ABA-Signalweg drehen, können die Identifizierung neuartiger ABA-unabhängiger Mechanismen verhindern, und (ii) In-vivo-Strategien zur Identifizierung bioaktiver kleiner Moleküle beruhen in erster Linie auf deren physiologischen Auswirkungen auf die Samenkeimung oder das Sämlingswachstum und nicht auf die Regulierung der Pflanzentranspiration.
Darüber hinaus gibt es viele Möglichkeiten, Pflanzen mit bioaktiven Molekülen zu behandeln, aber die meisten von ihnen sind nicht gut für eine groß angelegte Studie der stomatoalen Bewegung geeignet. Kurz gesagt, die drei häufigsten Techniken sind Blattanwendung durch Sprühen oder Tauchen, Behandlung des Wurzelsystems und Wurzelbewässerung. Die Blattanwendung ist nicht mit den gebräuchlichsten und schnellsten Methoden zur Messung der stomatalen Blende kompatibel, da das Vorhandensein von Tröpfchen an der Blattoberfläche die großangelegte Datenerfassung beeinträchtigt. Die Haupteinschränkungen der Wurzelbewässerung sind die großen Probenvolumenanforderungen, die potenzielle Retention der Verbindungen durch Elemente in der Rhizosphäre und die Abhängigkeit von aktiver Wurzelaufnahme.
Hier stellen wir eine groß angelegte Methode zur Identifizierung neuer Verbindungen vor, die die Pflanzentranspiration regulieren, die nicht unbedingt ABA- oder bekannte Trockenheitsreaktionsmechanismen beinhalten und eine effiziente und zuverlässige Behandlung von Anlagen ermöglichen. In diesem System werden Helianthus Annuus-Pflanzen mit einem Wurzelfütterungsansatz behandelt, der darin besteht, die Primärwurzel von hydroponisch angebauten Sämlingen zu schneiden und die schnittstelle in die Probenlösung zu tauchen. Nach der Behandlung wird die Wirkung jeder Verbindung auf die Transpiration von Pflanzen mit einer Infrarot-Wärmebildkamera gemessen. Da eine wesentliche Determinante der Blattoberflächentemperatur die Verdunstungsrate des Blattes ist, können Wärmebilddaten direkt mit der stomatalischen Leitfähigkeit korreliert werden. Die relative Veränderung der Blatttemperatur nach chemischer Behandlung bietet somit eine direkte Möglichkeit, die Pflanzentranspiration zu quantifizieren.
H. annuus ist eine der fünf größten Ölsaaten pflanzen in der Welt16 und Entdeckungen direkt auf dieser Pflanze gemacht kann zukünftige Transfer von Technologie zu erleichtern. Darüber hinaus haben H. annuus Sämlinge große und flache Kotyledonen, sowie eine dicke Primärwurzel, die ideal für die Entwicklung dieses Protokolls war. Diese Methode kann jedoch leicht an andere Pflanzen und eine Vielzahl von Verbindungen angepasst werden.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Moleküle effektiv zu identifizieren, die in der Lage sind, stomatale Verschluss zu lösen oder die stomasale Öffnung zu fördern, was erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der Signale hat, die die stomatole Leitfähigkeit und Die Anpassung der Anlage an die Umwelt regulieren. Betont.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anzahl der Verbindungen, die an einem bestimmten Tag getestet werden können, hängt hauptsächlich von (i) dem umweltkontrollierten Raum ab, der für den Anbau der Pflanzen und die Durchführung des Bildschirms zur Verfügung steht, sowie von (ii) von der Anzahl der Personen, die an Schritt 6 des Protokolls beteiligt werden können. Wir empfehlen die Verwendung von drei experimentellen Replikaten, um die Interpretation der Ergebnisse nach der statistischen Behandlung zu konsolidieren. An einem typischen Tag können …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch pomona College Start-up Funds und Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) sowie das Pomona College Molecular Biology Program durch das Stellar Summer Research Assistant Program (to KG) unterstützt.
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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