व्यक्तिगत लिपोसोम्स के बीच रचनात्मक इनमोमोसिटी का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसम परख
Summary
यह प्रोटोकॉल लिपोसोम्स के निर्माण का वर्णन करता है और इन्हें सतह पर कैसे स्थिर किया जा सकता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से व्यक्तिगत रूप से चित्रित किया जा सकता है। यह जनसंख्या के एकल लिपोसोम के बीच आकार और रचनात्मक अमोटिजनता के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है।
Abstract
झिल्ली मॉडल सिस्टम या दवा वितरण वाहक के रूप में लिपोसोम को नियोजित करने वाले अधिकांश शोध थोक पठन-आउट तकनीकों पर निर्भर करता है और इस प्रकार आंतरिक रूप से कलाकारों की टुकड़ी के सभी लिपोसोम को समान माना जाता है। हालांकि, एकल कण स्तर पर लिपोसोम का निरीक्षण करने में सक्षम नए प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों ने व्यक्तिगत लिपोसोम पर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन या ड्रग कैरियर गुणों पर अत्यधिक परिष्कृत और मात्रात्मक अध्ययन करना संभव बना दिया है, इस प्रकार कलाकारों की टुकड़ी औसत से त्रुटियों से परहेज । यहां हम फ्लोरेसेंस आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करके एकल लिपोसोम तैयार करने, पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिससे इस तरह के एकल कण मापको सुविधाजनक होती है। सेटअप एक बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से व्यक्तिगत liposomes इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और अंतर नमूना आकार और रचनात्मक असंगति प्रकट करने के लिए कार्यरत है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल एकल लिपोसोम स्तर पर लिपोसोम का अध्ययन करने के फायदों, परख की सीमाओं और अन्य शोध प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए इसे संशोधित करते समय विचार किए जाने वाले महत्वपूर्ण विशेषताओं का वर्णन करता है।
Introduction
लिपोसोम गोलाकार फॉस्फोलिपिड आधारित वेसिकल्स हैं जिनका बुनियादी और लागू अनुसंधान दोनों में भारी उपयोग किया जाता है। वे उत्कृष्ट झिल्ली मॉडल सिस्टम के रूप में कार्य करते हैं, क्योंकि उनके शारीरिक गुणों को लिपोसोम1,2बनाने वाले लिपिड घटकों को अलग करके आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। इसके अलावा, लिपोसोम्स सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले दवा वितरण नैनोकैरियर सिस्टम का गठन करते हैं, जो बेहतर फार्माकोकिनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स के साथ-साथ उच्च जैव अनुकूलता3की पेशकश करते हैं।
कई वर्षों के लिए, liposomes मुख्य रूप से थोक तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, केवल कलाकारों की टुकड़ी औसत पढ़ने के मूल्यों के लिए उपयोग दे रही है । यह इन अध्ययनों के बहुमत का नेतृत्व किया है लगता है कि कलाकारों की टुकड़ी में सभी liposomes समान हैं । हालांकि, इस तरह के पहनावा-औसत मूल्य केवल तभी सही हैं जब अंतर्निहित डेटासेट समान रूप से मतलब मूल्य के आसपास वितरित किया जाता है, लेकिन यदि डेटासेट में कई स्वतंत्र आबादी शामिल है, उदाहरण के लिए, एक झूठी और पक्षपातपूर्ण निष्कर्ष का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कलाकारों की टुकड़ी संभालने का मतलब पूरी आबादी का प्रतिनिधित्व करने के लिए liposomes के बीच inhomogeneity के भीतर बंदरगाह जानकारी को नजरअंदाज कर सकते हैं । हाल ही में मात्रात्मक परख उभरा है जो एकल लिपोसोम की जांच करने में सक्षम हैं, जिसमें लिपोसोम आकार4,लिपिड संरचना5,6और एनकैप्सुलेशन दक्षता7सहित महत्वपूर्ण भौतिक रासायनिक गुणों के संबंध में व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच बड़ी असंगति का खुलासा किया गया है, जो एकल लिपोसोम स्तर पर लिपोसोम का अध्ययन करने के महत्व को रेखांकित करता है।
एक शोध क्षेत्र जहां लिपोसोम गुणों के औसत से पहनावा पूर्वाग्रह परिणामों के लिए दिखाया गया है लिपोसोम आकार पर निर्भर प्रोटीन झिल्ली बातचीत8,9का अध्ययन कर रहा है । परंपरागत रूप से, ऐसी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं को विभिन्न ताकना आकार9के साथ फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालकर विभिन्न पहनावा औसत व्यास के साथ लिपोसोम तैयार करने तक सीमित किया गया है। हालांकि, एकल लिपोसोम परखों का उपयोग करके व्यक्तिगत लिपोसोम के व्यास को निकालने से बड़ी आबादी ओवरलैप हुई है, जिसमें लिपोसोम्स ने 100 एनएम और 200 एनएम फिल्टर का उपयोग करके अपने आकार वितरण4में 70% तक ओवरलैप प्रदर्शित किया है। यह लिपोसोम आकार-निर्भर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन10के थोक मापको गंभीर रूप से पूर्वाग्रह सकता है। एकल लिपोसोम परख का उपयोग करके झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन ों का प्रदर्शन करते हुए, शोधकर्ताओं ने इसके बजाय नमूने के भीतर आकार-पॉलीफैलाव का लाभ उठाया, जिससे उन्हें प्रत्येक प्रयोग के भीतर लिपोसोम व्यास की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने की अनुमति दी गई, जिससे नई खोजों को सुविधाजनक बनाया जा सके कि झिल्ली वक्रता और संरचना झिल्ली4,11,12में प्रोटीन भर्ती को कैसे प्रभावित कर सकती है। एक अन्य क्षेत्र जहां एकल लिपोसोम परखों के अनुप्रयोग ने सहायक सिद्ध किया है , प्रोटीन-मध्यस्थता झिल्ली संलयन13,14 के मशीनीअध्ययनोंमें है । इस तरह के गतिज मापन के लिए, व्यक्तिगत संलयन घटनाओं का अध्ययन करने की क्षमता संलयन प्रक्रिया के प्रयोगात्मक सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता को समाप्त कर दिया, नई यंत्रवादी अंतर्दृष्टि है कि अंयथा थोक पहनावा माप में किया स्थानिक औसत में खो गया है की अनुमति । इसके अतिरिक्त, एकल लिपोसोम का उपयोग झिल्ली पाड़ के रूप में किया गया है, जिससे व्यक्तिगत प्रोटीन की माप की अनुमति होती है और ट्रांसम्मेम्पल प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता15,16पर नए ज्ञान की पेशकश की जाती है। इसके अलावा, इस तरह के प्रोटेओलियोपोसोम-आधारित सेटअप ने व्यक्तिगत ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्टरों17 और पोर बनाने वाले प्रोटीन परिसरों18 के साथ-साथ बायोएक्टिव झिल्ली-पार्मेबिलाइजिंग पेप्टाइड्स19के तंत्र का अध्ययन करना संभव बनाया। एकल लिपोसोम का उपयोग सतह-स्थिर एकल लिपोसोम के साथ नरम पदार्थ नैनोफ्लूडिक के रूप में भी किया गया है जो10-19 एल की मात्रा में एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाओं के लिए कक्षों के रूप में सेवारत हैं, जो न्यूनतम उत्पाद खपत20के साथ स्क्रीनिंग परखों की थ्रूपुट और जटिलता को बढ़ा ते हैं।
हाल ही में, एक लिपोसोम परख विस्तार के पहले से ही अपूर्व स्तर पर दवा वितरण liposomes विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है । शोधकर्ता21व्यक्तिगत लिपोसोम ्स की सतह से जुड़े बहुलक की मात्रा में महत्वपूर्ण संक्षमता की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम थे । एकल लिपोसोम परखों ने जटिल मीडिया में दवा वितरण लिपोसोम के माप की भी अनुमति दी, जैसे रक्त प्लाज्मा, खुलासा कैसे लिपिड एंकर के माध्यम से लिपोसोम सतह पर लंगर डाले तत्वों को विवो परिसंचरण22में अनुभव के दौरान अनुभवी शर्तों के संपर्क में आने पर विसोशन के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है । कुल मिलाकर, बहुमुखी प्रतिभा और एकल लिपोसोम परख की उपयोगिता समस्याओं की महान विविधता इन सेटअप को संबोधित करने के लिए नियोजित किया गया है द्वारा प्रमाणित कर रहे हैं, और हम कल्पना है कि कार्यप्रणाली को विकसित किया जाना जारी रहेगा और नए वैज्ञानिक क्षेत्रों में उपयोग मिल ।
यहां हम एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसोम परख का वर्णन करते हैं जो व्यक्तिगत लिपोसोम ्स को उच्च-थ्रूपुट तरीके से अध्ययन करने की अनुमति देता है(चित्रा 1)। विधि को समझाने के लिए, हम इसका उपयोग एक कलाकारों की टुकड़ी के भीतर व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच आकार और रचनात्मक अमोटिजनता की मात्रा निर्धारित करने के लिए करते हैं। परख एक प्रचलित कांच की सतह पर स्थिर एकल लिपोसोम्स की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप इमेजिंग को नियोजित करता है। हम पहले लिपोसोम फैब्रिकेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं जो उचित फ्लोरोसेंट लिपोसोम लेबलिंग और स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है। फिर, हम उचित लिपोसोम सतह घनत्व सुनिश्चित करने की प्रक्रिया को रेखांकित करने से पहले लिपोसोम इम्मोबिलाइजेशन की सुविधा के लिए आवश्यक सतह तैयारी का वर्णन करते हैं। हम उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी मापदंडों पर चर्चा करते हैं और यह रेखांकित करते हैं कि कैसे सरल डेटा विश्लेषण करना है, जिससे लिपोसोम आकार और रचनात्मक अमोसिटी को निकालने की अनुमति मिलती है। इस जेनेरिक प्रोटोकॉल इच्छुक शोधकर्ता के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करने के लिए अपने या अपने विशिष्ट अनुसंधान ब्याज के लिए आगे परख विकसित करना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब तक हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच रचनात्मक अमोजातीयता का अध्ययन करने के लिए एकल लिपोसोम परख का उपयोग कैसे किया जा सकता है, तो मंच बहुत बहुमुखी…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च [ग्रांट नंबर 5054-00165B] द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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