角膜内皮细胞损失非侵入性激光辅助实验模型的发展
Summary
在这里，我们提出了一个协议，从Descemet的膜（DM）分离角膜内皮细胞（CEC），使用一个镉：YAG（Nd：YAG）激光作为牛角病（BK）的外活体疾病模型。
Abstract
Nd：YAG激光器已经用于进行非侵入性的眼内手术，如眼内切除术几十年了。精辟效果依赖于激光对焦处的光学故障。产生声冲击波和气穴气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量和焦点位置而变化。在这项研究中，被包裹的猪眼被放置在商业上可用的Nd：YAG激光器前。测试了角膜后焦点的不同位置的可变脉冲能量以及不同位置。由此产生的病变通过双光子显微镜和组织学进行评估，以确定角膜内皮细胞（CEC）唯一分离的最佳参数，并尽量减少附带损害。该方法的优点是CEC的精确消融，减少附带损害，最重要的是非接触式处理。
Introduction
角膜的透明度对于将光传输到视网膜及其光感受器1至关重要。在这方面，相对脱水状态对于保持角膜基质内的胶原纤维正确对齐至关重要。这种平衡由位于Descemet膜（DM）2上的角膜内皮细胞（CEC）维持。内皮是最内层角膜层。它有一个重要的屏障和泵功能，这是角膜透明度3的关键。与上皮相比，内皮不能自我更新4。因此，疾病或创伤造成的任何细胞损伤刺激剩余的内皮细胞扩大和迁移，覆盖由此产生的缺陷，并保持角膜功能5。然而，如果CEC密度低于临界阈值，内皮的解值会导致水肿，导致视力模糊和不适，甚至剧烈疼痛4。尽管有缓解症状的药物，目前这些病例中唯一的明确治疗方法是角膜移植，这种移植可以以全厚移植或角膜内皮移植的形式进行。后一个程序是作为Descemet的膜内皮角膜（DMEK）以及Descemet的剥离自动内皮角膜（DSAEK）6。6然而，保护剩余的CEC并增强其生存能力可能是一个替代目标，这需要一个适当的疾病模型来测试潜在的治疗药物。
目前的CEC损失病模型侧重于通过注射有毒物质（如氯化苯甲酸酯）或使用侵入性脱氨血症技术77、88的细胞机械磨损来破坏内皮。虽然这些模型已经确立，但存在一般炎症反应和不精确的附带损害等缺点。因此，这些模型更有可能代表疾病的最后阶段，当上述手术选择是不可避免的。
随着干细胞和基因治疗等细胞治疗策略的进步，这些细胞疗法的应用在CEC损失9的早期阶段可能很有用。随后，我们需要一个模型，更充分地代表疾病的这些早期阶段。在这方面，细胞培养模型在过去十年中有所改善，但其有效性仍然有限，因为体外细胞无法接近于复制角膜10内不同细胞类型之间发生的复杂相互作用。因此，活体和体内疾病模型仍然需求量大，改进现有的模式是十分感兴趣的。
非侵入性，眼内手术通过光干扰使用镉：YAG （Nd：YAG） 激光已成为世界各地的眼科医生的例行程序，因为它在20世纪70年代末推出11.光中断依赖于非线性光吸收，导致等离子体的形成，产生声冲击波，并产生气穴气泡，每当应用地点位于液体环境中12。一般来说，这些过程有助于精确组织切割的预期效果。然而，它们也可能成为不必要的附带损害的来源，限制了当地对激光手术的监禁。
通过对冲击波传播和气穴过程的表征，对由此产生的机械效应的预测有了显著改善。我们的目标是以尽可能少地破坏周围组织而达到CEC为目标，为CEC损失的早期阶段提供非侵入性激光辅助实验疾病模型。为此，有必要确定激光焦点的最佳脉冲能量和位置。
Protocol
Representative Results
Discussion
试验研究结果表明，在选择能量剂量和焦点位置的适当参数时，Nd：YAG激光器可用于选择性地退位角膜内皮细胞。
由于内皮功能对角膜透明度和角膜免受基质水肿影响十分重要，内皮功能障碍模型在抗水肿药物或外科手术的发展中起着重要作用。有几个既定的体外模型来模拟体内情况10，14，15，但众所周知，体外模型不能完全模仿酶和细胞因子的影响或细胞-细胞相互作用的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢克里斯蒂娜·奥伦和扬·阿·苏楚雷克在实验方法方面的帮助。
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
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