Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).
Abstract
Nd:YAG lasers ont été utilisés pour effectuer la chirurgie intraoculaire non invasive, comme la capsulotomie depuis plusieurs décennies maintenant. L’effet incisif repose sur la dégradation optique au laser. Des ondes de choc acoustiques et des bulles de cavitation sont générées, provoquant une rupture tissulaire. La taille des bulles et les amplitudes de pression varient en fonction de l’énergie des impulsions et de la position du point focal. Dans cette étude, des yeux porcins enucléés ont été placés devant un laser Nd:YAG disponible dans le commerce. Des énergies variables d’impulsion ainsi que différentes positions des taches focales postérieures à la cornée ont été testées. Les lésions résultantes ont été évaluées par microscopie et histologie à deux photon pour déterminer les meilleurs paramètres pour un détachement exclusif des cellules endothéliales cornéennes (CEC) avec des dommages collatéraux minimaux. Les avantages de cette méthode sont l’ablation précise de la CEC, la réduction des dommages collatéraux, et surtout le traitement sans contact.
Introduction
La transparence de la cornée est essentielle pour la transmission de la lumière à la rétine et ses photorécepteurs1. À cet égard, un état relatif de déshydratation est essentiel pour garder les fibres de collagène dans le stroma cornéen correctement aligné. Cette homéostasie est maintenue par des cellules endothéliales cornéennes (CEC) situées sur la membrane du Descemet (DM)2. L’endothélium est la couche cornéenne la plus intime. Il a une barrière importante et la fonction de pompe, qui est cruciale pour la transparence cornéenne3. Contrairement à l’épithélium, l’endothélium n’est pas en mesure de se renouvelersoi-même 4. Par conséquent, tout dommage cellulaire causé par la maladie ou le traumatisme stimule les cellules endothéliales restantes à agrandir et à migrer, à couvrir les défauts résultants et à maintenir la fonctionnalité cornéenne5. Cependant, si la densité de la CEC tombe en dessous d’un seuil critique, la décompensation de l’endothélium conduit à un œdème, entraînant une vision floue et l’inconfort ou même une douleur sévère4. En dépit de la disponibilité des drogues pour soulager des symptômes, actuellement le seul traitement définitif dans ces cas est la transplantation cornéenne, qui peut être exécutée sous la forme d’une greffe pleine épaisseur ou d’une transplantation endothéliale lamellaire. Cette dernière procédure est disponible sous forme de kératomie endothéliale membrane de Descemet (DMEK) ainsi que de la kératothéplastie endothéliale automatisée de Descemet (DSAEK)6. Cependant, la protection du maintien de la CEC et l’amélioration de leur survie pourraient être une cible alternative, qui a besoin d’un modèle de maladie adéquat pour tester les médicaments thérapeutiques potentiels.
Les modèles actuels de la maladie de perte de CEC se concentrent sur la destruction de l’endothélium par l’injection d’agents toxiques (p. ex., chlorure de benzalkonium) dans la chambre antérieure ou par abrasion mécanique des cellules utilisant une technique invasive de descemétorhexis7,8. Bien que ces modèles soient bien établis, des inconvénients tels que la réponse inflammatoire générale et les dommages collatéraux imprécis existent. Par conséquent, ces modèles sont plus susceptibles de représenter les derniers stades de la maladie, lorsque les options chirurgicales mentionnées ci-dessus sont inévitables.
Avec les progrès dans les stratégies de traitement cellulaire tels que les cellules souches et la thérapie génique, l’application de ces thérapies cellulaires pourrait être utile dans les premiers stades de la perte de CEC9. Par la suite, nous avons besoin d’un modèle qui représente ces premiers stades de la maladie de façon plus adéquate. À cet égard, les modèles de culture cellulaire se sont améliorés au cours de la dernière décennie, mais sont encore limités dans leur validité, que les cellules in vitro ne peuvent pas venir près de reproduire les interactions complexes qui se produisent entre les différents types de cellules dans la cornée10. Par conséquent, les modèles de maladies ex vivo et in vivo sont toujours en forte demande et l’amélioration des modèles existants est d’un intérêt primordial.
La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes du monde entier depuis son introduction à la fin des années 197011. La photodissoupstion repose sur l’absorption de la lumière non linéaire conduisant à la formation de plasma, à la génération d’ondes de choc acoustiques et à la création de bulles de cvitation, chaque fois que le site d’application est situé dans un environnement liquide12. En général, ces processus contribuent à l’effet prévu de la coupe précise des tissus. Cependant, ils peuvent également être la source de dommages collatéraux inutiles limitant l’enfermement local de la chirurgie au laser13.
La prédiction des effets mécaniques résultants s’est considérablement améliorée grâce à la caractérisation de la propagation de l’onde de choc et du cours de cvitation. Notre objectif est de cibler la CEC avec le moins de dommages possible aux tissus environnants afin de fournir un modèle de maladie expérimentale non invasif et assisté par laser pour les premiers stades de la perte de la CEC. À cette fin, il est nécessaire de déterminer les énergies et les positions optimales des impulsions du laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les résultats de cette étude pilote indiquent qu’un laser Nd:YAG peut être utilisé pour abler sélectivement les cellules endothéliales cornéennes lorsque des paramètres appropriés pour la dose d’énergie et la position de point de focalisation sont choisis.
Comme la fonction endothéliale est importante pour la transparence cornéenne et la sauvegarde de la cornée contre l’oedème stromal, les modèles de dysfonctionnement endothélial jouent un rôle important dans le dévelop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Christine ‘ron et Jan A. M. Sochurek pour leur aide à l’expérimentation.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
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