ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ
Summary
このプロトコルは、空間的に制御された好中球群を提供するバイオ粒子マイクロアレイを生成する。これは、好中球が移行中に放出するメディエーターに容易にアクセスでき、定量的な画像分析を可能にします。
Abstract
好中球の群れは、好中球が感染部位を封鎖し、組織の再編成を促進する協調プロセスである。群れの特徴を示す動物モデルにおいて、細胞移動の特徴的なパターンを示す動物モデルにおいて、古典的に生体内で研究されている。しかし、in vivoモデルには、アクセスと分析が困難な細胞間メディエーター、およびヒト好中球を直接分析することができないなど、いくつかの制限があります。これらの制限のため、ヒト好中球で群りを研究し、群れの間に生成される分子信号に容易にアクセスできるin vitroプラットフォームが必要です。ここでは、多段階マイクロスタンププロセスを使用して、生体内感染を模倣して群れを刺激するバイオ粒子マイクロアレイを生成します。バイオ粒子マイクロアレイは、制御された安定した方法で群れを作る好中球を誘導する。マイクロアレイでは、好中球は速度が上昇し、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成します。さらに、好中球によって生成された上清が分析され、16個のタンパク質が群れの過程で異なって発現されていたことが発見された。このインビトロ・ストウォーミング・プラットフォームは、再現性のある空間的に制御された方法で好中球の移動およびタンパク質放出を直接分析します。
Introduction
好中球は、血流1で最も豊富な白血球であり、潜在的な診断および治療標的として注目を集めている2,3は、色あさ4、敗血症、外傷5、6、癌1、7、8、および様々な自己免疫疾患5,9を含む様々な病状に関与する可能性があるためである。好中球の群れは、多段階で厳しく調節されたプロセスであり、複雑さを伴う複雑性を有し、研究5、10、11の特に興味深い焦点となっている。群れの間、好中球は周囲の健康な組織5、10、11から炎症部位を単離する。好中球群れの適切な調節は創傷治癒を促進するために不可欠であり、最終的には炎症解決5、12。好中球の群れは、主にげっ歯類12、13、14、15およびゼブラフィッシュ10、11、12、15モデルで生体内で研究されている。しかし、これらのin vivo動物モデルの性質は、制限5を生じさせる。例えば、群れの間に好中球によって放出されるメディエーターは、分析5のために容易にアクセスできない。さらに、インビボで与えられたメディエーターには多くの潜在的な情報源があるので、インビボ実験は、所定のプロセス13におけるそのメディエーターの役割を調査するために細胞産生および/または相互作用を阻害する遺伝的欠乏を導入しなければならない。インビトロ実験は、追加の細胞のコンテキストなしで好中球観察を可能にすることによって、この合併症を回避する。さらに、ヒト好中球協調移動を記述する研究は限られた16である。インビトロの群れプラットフォームでは、ヒト好中球を直接分析することができます。インビトロの群れのプラットフォームは、in vivo研究の限界によって残されたギャップを埋める機会を提供することによって、インビボ研究から得られた知識を拡大する可能性がある。
インビボ好中球群れを模倣するインビトロプラットフォームの必要性に対処するために、好中球の群れを空間的に制御した方法でバイオ粒子マイクロアレイをパターン化できるマイクロスタンププラットフォームを開発しました。2段階のプロセスで、ガラススライド上にバイオ粒子マイクロアレイを生成します。まず、マイクロスタンプを使用して、カチオン性多電解質(CP)スポットのマイクロアレイを生成します。次に、静電気相互作用を介してCPスポットに付着するバイオ粒子の溶液を添加します。まずCP層をパターン化することにより、負に帯電したバイオ粒子を選択的にパターン化して、所望の好中球群れパターンを生成することができる。正に荷電した層は、CPを持たないガラススライド上の領域から生体粒子を取り除く精力的な洗浄ステップを経て負に荷電した生体粒子を保持する。これは、ガラススライドにミクロンサイズのバイオ粒子を固定化する非常に高い表面電荷を有し、したがって、ガラススライド上のパターン化された位置から粒子を除去することから好中球を阻害する。これは、マイクロアレイに配置されたバイオ粒子クラスターをもたらす。マイクロアレイに好中球を加えたところ、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成しました。好中球の移動を追跡すると、群れの好中球が積極的にバイオ粒子クラスターに向かって移動することがわかりました。さらに、このプラットフォームを使用して、群れの間に好中球が放出する特定のメディエーターを分析しました。群れの間に差を出して表現される16のメディエーターを見つけました。彼らの濃度は、時間の経過とともに3つの一般的な傾向に従います: 増加, 減少, またはスパイク.私たちのインビトロ好中球群れプラットフォームは、空間的に制御されたヒト好中球群れの分析、ならびに好中球群れによって放出されるメディエーターの収集と分析を容易にする。以前の出版物では、特定の病状(外傷、自己免疫疾患、敗血症)を有する患者が、健康なドナーからの患者とは異なる機能を有する好中球を有することを実証した5。今後の研究では、当社のプラットフォームを使用して、さまざまな患者集団の中で好中球機能を分析することができます。このプラットフォームは、好中球群れの複雑な配位を定量的に分析することができる。特定の患者集団の好中球機能または目的の病原体に対する好中球応答に関する洞察を提供するために、追加の研究を行うことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロ好中球群を刺激するバイオ粒子の均一な配列を生成するマイクロスタンププラットフォームを開発しました。私たちのプラットフォームのインビトロの性質は、私たちはin vivo群れの実験、すなわち群れの好中球5によって放出されるメディエーターを分析する能力が低い、で生じる合併症を回避することを可能にします。さらに、in vivoモデルは、通常、げっ歯類1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ウィリアム・G・ロウリー化学・生体分子工学科とオハイオ州立大学総合がんセンターからの資金提供によって支えられた。このレポートで示されたデータは、オハイオ州立大学キャンパス顕微鏡イメージング施設で利用可能なイマリスx64(9.3.0ビットプレーン)を使用して処理された画像から来ました。この施設は、助成金P30 CA016058、国立がん研究所、ベセスダ、MDによって部分的にサポートされています。
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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