Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro
Summary
Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.
Abstract
Neutrofiele zwermen is een coöperatief proces waarbij neutrofielen verzegelen van een site van infectie en het bevorderen van weefsel reorganisatie. Zwermen is klassiek in vivo bestudeerd in diermodellen die karakteristieke patronen van celmigratie vertonen. Echter, in vivo modellen hebben verschillende beperkingen, waaronder intercellulaire bemiddelaars die moeilijk toegankelijk en te analyseren, evenals het onvermogen om direct te analyseren menselijke neutrofielen. Vanwege deze beperkingen is er behoefte aan een in vitro platform dat zwermen met menselijke neutrofielen bestudeert en gemakkelijke toegang biedt tot de moleculaire signalen die tijdens zwermen worden gegenereerd. Hier wordt een multistep microstempelingsproces gebruikt om een biodeeltjesmicroarray te genereren die zwermen stimuleert door een in vivo infectie na te bootsen. De biodeeltjesmicroarray veroorzaakt neutrofielen om op een gecontroleerde en stabiele manier te zwermen. Op de microarray nemen neutrofielen toe in snelheid en vormen stabiele zwermen rond biodeeltjesclusters. Bovendien werd supernatant gegenereerd door de neutrofielen geanalyseerd en 16 eiwitten werden ontdekt te zijn differentieel uitgedrukt in de loop van zwermen. Dit in vitro zwermplatform faciliteert directe analyse van neutrofiele migratie en eiwitafgifte op een reproduceerbare, ruimtelijk gecontroleerde manier.
Introduction
Neutrofielen, de meest voorkomende witte bloedcellen in de bloedbaan1, krijgen aandacht als potentiële diagnostische en therapeutische doelen2,3 omdat ze betrokken kunnen zijn bij een verscheidenheid van medische aandoeningen, waaronder jicht4, sepsis3, trauma5,6, kanker1,7,8, en diverse auto-immuunziekten5,9. Neutrofiele zwermen is een meertraps, strak gereguleerd proces met een complexiteit die het een bijzonder interessante focus van studie5,10,11maakt. Tijdens zwermen isoleren neutrofielen een ontstekingsplaats van het omringende gezonde weefsel5,10,11. Een goede regulering van neutrofiele zwermen is essentieel om wondgenezing en uiteindelijk ontstekingsresolutie5,12te bevorderen. Neutrofiele zwermen is voornamelijk onderzocht in vivo in knaagdier12,13,14,15 en zebravissen10,11,12,15 modellen. De aard van deze in vivo diermodellen leidt echter tot beperkingen5. Bijvoorbeeld, de bemiddelaars vrijgegeven door neutrofielen tijdens zwermen zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor analyse5. Daarnaast zijn er veel potentiële bronnen voor een bepaalde bemiddelaar in vivo, dus een in vivo experiment moet een genetisch tekort introduceren om cellulaire productie en/of interactie te remmen om de rol van die bemiddelaar in een bepaald proces te onderzoeken13. Een in vitro experiment omzeilt deze complicatie door neutrofiele observatie mogelijk te maken zonder de context van extra cellen. Bovendien is het onderzoek naar menselijke neutrofiele gecoördineerde migratie beperkt16. Op een in vitro zwermen platform, kunnen menselijke neutrofielen direct worden geanalyseerd. Een in vitro zwermen platform zou kunnen uitbreiden op de kennis opgedaan uit in vivo studies door het verstrekken van mogelijkheden om de lacunes achtergelaten door de beperkingen van in vivo studies op te vullen.
Om tegemoet te komen aan de behoefte aan een in vitro platform dat in vivo neutrofiele zwermen nabootst, ontwikkelden we een microstempelplatform dat ons in staat stelt om biodeeltjesmicroarrays te patronen die neutrofiele zwermen op een ruimtelijk gecontroleerde manier stimuleren. We genereren biodeeltjesmicroarrays op glasplaten in een proces in twee stappen. Ten eerste gebruiken we microstempeling om een microarray van kationische polyelektrolyt (CP) vlekken te genereren. Ten tweede voegen we een oplossing toe van biodeeltjes die zich via elektrostatische interactie aan de CP-vlekken hechten. Door eerst de CP-laag te patroon, kunnen we selectief negatief geladen biodeeltjes patroon om het gewenste neutrofiele zwermpatroon te genereren. De positief geladen laag houdt de negatief geladen biodeeltjes vast door de krachtige wasstap die de biodeeltjes verwijdert uit de gebieden op de glasplaat die de CP niet hebben. Bovendien is de HIER gebruikte CP, een copolymeer van acrylamide en quaternized cationic monomeer, biocompatibel, dus het induceert geen reactie van de neutrofielen. Het heeft een zeer hoge oppervlaktelading die de micron-sized biodeeltjes aan de glasdia immobiliseert, waarbij neutrophils worden geremd van het verwijderen van de deeltjes uit de patroonpositie op de glasdia. Dit resulteert in biodeeltjesclusters die in een microarray worden gerangschikt. Toen we neutrofielen aan de microarray toevoegden, vormden ze stabiele zwermen rond de biodeeltjesclusters. Door het volgen van neutrofiele migratie, vonden we dat zwermen neutrofielen actief migreren naar de biodeeltjes clusters. Bovendien gebruikten we dit platform om bepaalde bemiddelaars te analyseren die neutrofielen loslaten tijdens zwermen. We vonden 16 bemiddelaars die differentieel worden uitgedrukt tijdens zwermen. Hun concentraties volgen drie algemene trends in de tijd: verhogen, dalen of pieken. Ons in vitro neutrofiele zwermplatform faciliteert de analyse van ruimtelijk gecontroleerde menselijke neutrofiele zwermen, evenals de verzameling en analyse van bemiddelaars die vrijkomen door neutrofiele zwermen. In een eerdere publicatie toonden we aan dat patiënten met bepaalde medische aandoeningen (trauma, auto-immuunziekte en sepsis) neutrofielen hadden die anders functioneerden dan die van gezonde donoren5. In toekomstige onderzoeken kan ons platform worden gebruikt om de neutrofiele functie bij verschillende patiëntenpopulaties te analyseren. Dit platform kan kwantitatief analyseren van de complexe coördinatie die betrokken zijn bij neutrofiele zwermen. Aanvullende studies kunnen worden gedaan om inzicht te geven in de neutrofiele functie van een specifieke patiëntenpopulatie of neutrofiele reactie op een ziekteverwekker van belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een microstempelplatform om uniforme arrays van biodeeltjes te genereren om in vitro neutrofiele zwermen te stimuleren. De in vitro aard van ons platform stelt ons in staat om de complicaties die zich voordoen met in vivo zwermen experimenten te omzeilen, namelijk de slechte mogelijkheid om bemiddelaars vrijgegeven door zwermenneutrofielen te analyseren5. Bovendien worden in vivo modellen meestal uitgevoerd bij knaagdieren11,12</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering en het Comprehensive Cancer Center aan de Ohio State University. De gegevens die in dit rapport werden gepresenteerd, kwamen van beelden die zijn verwerkt met Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) die beschikbaar zijn op de Campus Microscopy and Imaging Facility, the Ohio State University. Deze faciliteit wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidie P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
