생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이
Summary
이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.
Abstract
호중구 떼는 호중구가 감염 부위를 봉인하고 조직 재구성을 촉진하는 협력 과정입니다. 떼는 세포 이동의 특징적인 패턴을 보여주는 동물 모델에서 생체 내에서 고전적으로 연구되었습니다. 그러나 생체 내 모델에는 접근 및 분석이 어려운 세포간 중재자뿐만 아니라 인간 호중구를 직접 분석할 수 없는 등 여러 가지 한계가 있습니다. 이러한 제한 때문에, 인간 호중구로 떼지어 연구하고 떼지어 다니는 동안 생성되는 분자 신호에 쉽게 접근할 수 있는 시험관 내 플랫폼이 필요합니다. 여기서, 다단계 마이크로스탬핑 공정은 생체 내 감염을 모방하여 떼지어를 자극하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성하는 데 사용된다. 생체 입자 마이크로 어레이는 호중구가 제어되고 안정적인 방식으로 무리를 유도합니다. 마이크로어레이에서 호중구는 속도가 증가하고 생물입자 클러스터 주변에 안정된 무리를 형성합니다. 추가적으로, 호중구에 의해 생성된 상온제는 분석되고 16개의 단백질은 무리의 과정을 통해 분별적으로 표현된 것으로 밝혀졌습니다. 이 시험관 내 무리 플랫폼은 재생 가능한 공간 제어 방식으로 호중구 이동 및 단백질 방출에 대한 직접적인 분석을 용이하게 합니다.
Introduction
혈류에서가장 풍부한 백혈구인 호중구는 1,3,2,3, 구획4,패혈증3,외상5,6,암1,7,8,각종 자가면역 질환5,9등 다양한 의료 조건에 관여할 수 있기 때문에 잠재적 진단 및 치료 표적으로 주목받고 있다. 호중구 떼는 연구5,10,11의특히 흥미로운 초점을 만드는 복잡성과다단계,엄격하게 규제 과정입니다. 무리 동안 호중구는 주변의 건강한 조직으로부터 염증 부위를분리5,10,11. 호중구 무리의 적절한 조절은 상처 치유와 궁극적으로 염증 해결을 촉진하는 데 필수적이다5,12. 호중구 떼는 주로 설치류12,13,14,15 및 제브라피시10,11,12,15 모델에서 생체 내에서 연구되었다. 그러나, 이러한 생체 내 동물 모델의 특성상 한계를 야기한다5. 예를 들어, 무리 동안 호중구에 의해 방출 된 중재자는 분석5에쉽게 접근 할 수 없습니다. 추가적으로, 생체 내에서 주어진 중재자에 대한 많은 잠재적인 공급원이 존재하므로 생체 내 실험은 주어진 프로세스에서 그 중재자의 역할을 조사하기 위해 세포 생산 및/또는 상호작용을 억제하는 유전적 결핍을 도입해야 한다13. 시험관 내 실험은 추가 세포의 맥락없이 호중구 관찰을 가능하게하여이 합병증을 우회. 추가적으로, 인간 호중구 조정한 이주를 기술하는 연구는16. 생체 외에서 무리 플랫폼에서, 인간의 호중구는 직접 분석 할 수 있습니다. 생체 외에서 떼지어 플랫폼은 생체 내 연구의 한계에 의해 남겨진 격차를 채울 수있는 기회를 제공함으로써 생체 내 연구에서 얻은 지식을 확장 할 수 있습니다.
생체 내 호중구 떼를 모방하는 체외 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해, 우리는 공간적으로 제어 된 방식으로 호중구 떼를 자극하는 바이오 입자 마이크로 어레이를 패턴화 할 수있는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리는 2 단계 공정에서 유리 슬라이드에 생체 입자 마이크로 어레이를 생성합니다. 첫째, 마이크로스탬핑을 사용하여 양이온폴리전해질(CP) 반점의 마이크로어레이를 생성합니다. 둘째, 정전기 상호 작용을 통해 CP 반점에 부착되는 바이오 입자 용액을 추가합니다. 먼저 CP 층을 패터닝함으로써, 우리는 원하는 호중구 군집 패턴을 생성하기 위해 음전하 바이오 입자를 선택적으로 패턴화 할 수 있습니다. 양전하층은 CP가 없는 유리 슬라이드의 영역에서 바이오입자를 제거하는 활발한 세척 단계를 통해 음전하된 바이오입자를 보유합니다. 그것은 유리 슬라이드에 미론 크기의 바이오 입자를 고정시키는 매우 높은 표면 전하를 가지며, 따라서 유리 슬라이드의 패턴 위치에서 입자를 제거하는 호중구를 억제합니다. 이로 인해 마이크로어레이로 배열된 생체 입자 클러스터가 생성됩니다. 우리가 마이크로어레이에 호중구를 추가했을 때, 그들은 생물입자 클러스터 주위에 안정된 무리를 형성했습니다. 호중구 이동추적을 통해, 우리는 호중구떼가 생체입자 클러스터로 적극적으로 이동한다는 것을 발견했습니다. 또한, 우리는 호중구가 떼지어 다니는 동안 방출되는 특정 중재자를 분석하기 위해이 플랫폼을 사용했습니다. 우리는 무리를 지어 다니는 동안 차별화된 16개의 중재자를 발견했습니다. 그들의 농도 는 시간이 지남에 따라 세 가지 일반적인 추세를 따릅니다: 증가, 감소, 또는 스파이크. 우리의 체외 호중구 떼 플랫폼은 공간적으로 제어 된 인간 호중구 무리의 분석뿐만 아니라 호중구 무리에 의해 발표 된 중재자의 수집 및 분석을 용이하게합니다. 이전 간행물에서, 우리는 특정 건강 상태 (외상, 자기 면역 질병 및 패혈증)를 가진 환자가 건강한 기증자에서 그것과 다르게 작동하는 호중구가 있었다는 것을 보여주었습니다5. 향후 연구 연구에서, 우리의 플랫폼은 다양한 환자 집단 사이에서 호중구 기능을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 이 플랫폼은 호중구 무리에 관련된 복잡한 조정을 정량적으로 분석할 수 있다. 추가 연구는 관심있는 병원체에 대한 특정 환자 집단 또는 호중구 반응의 호중구 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 수행 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 시험관 내 호중구 무리를 자극하기 위해 균일 한 바이오 입자 배열을 생성하는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리의 플랫폼의 체외 특성은 우리가 생체 내 무리 실험으로 발생하는 합병증을 우회 할 수 있습니다, 즉 호중구를 무리에 의해 방출 중재자를 분석 할 수있는 가난한 능력5. 또한 생체 내 모델은 일반적으로 설치류11,<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 일은 오하이오 주립 대학에 있는 화학과 생물 분자 공학의 윌리엄 G. Lowrie 부 및 포괄적인 암 센터에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 이 보고서에 제시된 데이터는 오하이오 주립 대학의 캠퍼스 현미경 및 이미징 시설에서 사용할 수 있는 Imaris x64(9.3.0 비트플레인)를 사용하여 처리된 이미지에서 나왔습니다. 이 시설은 보조금 P30 CA016058, 국립 암 연구소, 베데스다, MD에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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