Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro
Summary
Este protocolo gera micromatrizes de biopartículas que fornecem enxame de neutrófilos espacialmente controlados. Ele fornece fácil acesso aos mediadores que os neutrófilos liberam durante a migração e permite análise quantitativa de imagem.
Abstract
O enxame de neutrófilos é um processo cooperativo pelo qual os neutrófilos selam um local de infecção e promovem a reorganização tecidual. Swarming tem sido estudado clássicamente in vivo em modelos animais mostrando padrões característicos de migração celular. No entanto, nos modelos vivo possuem várias limitações, incluindo mediadores intercelulares que são de difícil acesso e análise, bem como a incapacidade de analisar diretamente os neutrófilos humanos. Devido a essas limitações, há a necessidade de uma plataforma in vitro que estude com neutrófilos humanos e ofereça fácil acesso aos sinais moleculares gerados durante o enxame. Aqui, um processo de microcarimbo múltiplo é usado para gerar uma micromatriz de biopartículas que estimula o enxame imitando uma infecção in vivo. A micromatriz de biopartículas induz os neutrófilos a se aglomerarem de forma controlada e estável. Na micromatriz, os neutrófilos aumentam a velocidade e formam enxames estáveis em torno de aglomerados de biopartículas. Além disso, o supernatante gerado pelos neutrófilos foi analisado e 16 proteínas foram descobertas como expressos diferencialmente ao longo do aquecimento. Esta plataforma de aquecimento in vitro facilita a análise direta da migração de neutrófilos e liberação de proteínas de forma reprodutível e controlada espacialmente.
Introduction
Os neutrófilos, os mais abundantes glóbulos brancos da corrente sanguínea1,estão ganhando atenção como potenciais metas diagnósticas e terapêuticas2,3, porque podem estar envolvidos em uma variedade de condições médicas, incluindo gota4,sepse3, trauma5,6,câncer1,7,8, e várias doenças autoimunes5,9. O enxame de neutrófilos é um processo multiestágio, fortementeregulado com uma complexidade que o torna um foco particularmente interessante do estudo5,10,11. Durante o enxame, os neutrófilos isolamum local de inflamação do tecido saudável circundante5,10,11. A regulação adequada do enxame de nêutrons é essencial para promover a cicatrização da ferida e, finalmente, a resolução de inflamação5,12. O enxame de neutrófilos tem sido estudado principalmente em roedores12,13,14,15 e zebrafish10,11,12,15 modelos. No entanto, a natureza desses modelos animais vivos dá origem a limitações5. Por exemplo, os mediadores liberados por neutrófilos durante o enxame não são facilmente acessíveis para análise5. Além disso, existem muitas fontes potenciais para um determinado mediador in vivo, por isso um experimento in vivo deve introduzir uma deficiência genética para inibir a produção celular e/ou interação, a fim de investigar o papel desse mediador em um determinado processo13. Um experimento in vitro contorna essa complicação permitindo a observação de neutrófilos sem o contexto de células adicionais. Além disso, pesquisas que descrevem a migração coordenada por neutrófilos humanos são limitadasem 16. Em uma plataforma de enxame in vitro, os neutrófilos humanos podem ser diretamente analisados. Uma plataforma de enxame in vitro poderia expandir o conhecimento adquirido a partir de estudos in vivo, proporcionando oportunidades para preencher as lacunas deixadas pelas limitações dos estudos in vivo.
Para atender à necessidade de uma plataforma in vitro que imita o aquecimento vivo de neutrófilos, desenvolvemos uma plataforma de microestampagem que nos permite padronizar micromatrizes de biopartículas que estimulam o aquecimento de neutrófilos de forma espacialmente controlada. Geramos micromatrizes de biopartículas em slides de vidro em um processo de duas etapas. Primeiro, usamos microestampagem para gerar uma micromatriz de manchas de polieletrolito cdoico (CP). Em segundo lugar, adicionamos uma solução de biopartículas que aderem às manchas CP via interação eletrostática. Ao padronizar primeiro a camada CP, podemos padronizar seletivamente partículas carregadas negativamente para gerar o padrão desejado de aquecimento de neutrófilos. A camada positivamente carregada contém as biopartículas carregadas negativamente através da etapa vigorosa de lavagem que remove as biopartículas das áreas no deslizamento de vidro que não têm o CP. Além disso, o CP usado aqui, um copolímero de acrilamida e momer cationic quaternizado, é biocompatível, por isso não induz uma resposta dos neutrófilos. Ele tem uma carga superficial muito alta que imobiliza as biopartículas do tamanho de mícrons para o deslizamento de vidro, inibindo assim os neutrófilos de remover as partículas da posição padronizada no deslizamento de vidro. Isso resulta em agrupamentos de biopartículas dispostos em uma micromatriz. Quando adicionamos neutrófilos à micromatriz, eles formaram enxames estáveis ao redor dos aglomerados de biopartículas. Através do rastreamento da migração de neutrófilos, descobrimos que os neutrófilos migram ativamente para os aglomerados de biopartículas. Além disso, usamos esta plataforma para analisar certos mediadores que os neutrófilos liberam durante o enxame. Encontramos 16 mediadores que são expressos diferencialmente durante o enxame. Suas concentrações seguem três tendências gerais ao longo do tempo: aumento, diminuição ou pico. Nossa plataforma de aquecimento de neutrófilos in vitro facilita a análise do enxame de neutrófilos humanos controladoespacialmente, bem como a coleta e análise de mediadores liberados pelo swarming de neutrófilos. Em uma publicação anterior, demonstramos que pacientes com determinadas condições médicas (trauma, doença autoimune e sepse), tinham neutrófilos que funcionavam de forma diferente daqueles de doadores saudáveis5. Em estudos futuros, nossa plataforma poderia ser usada para analisar a função neutrófilo entre uma variedade de populações de pacientes. Esta plataforma pode analisar quantitativamente a complexa coordenação envolvida no aquecimento de neutrófilos. Estudos adicionais podem ser feitos para fornecer informações sobre a função neutrófilo de uma população específica de pacientes ou resposta neutrófilo a um patógeno de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos uma plataforma de microestampagem para gerar matrizes uniformes de biopartículas para estimular o aquecimento in vitro de neutrófilos. A natureza in vitro de nossa plataforma nos permite contornar as complicações que surgem com experimentos in vivo, ou seja, a má capacidade de analisar mediadores liberados por neutrófilos5. Além disso, os modelos vivos são tipicamente realizados em roedores11,12,<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Departamento de Engenharia Química e Biomolecular William G. Lowrie e do Centro De Câncer Abrangente da Universidade Estadual de Ohio. Os dados apresentados neste relatório vieram de imagens processadas usando Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponíveis no Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Esta instalação é apoiada em parte pela bolsa P30 CA016058, Instituto Nacional de Câncer, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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