Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro
Summary
Detta protokoll genererar biopartikelmikroarrayer som ger rumsligt kontrollerad neutrofilssvärmar. Det ger enkel tillgång till medlare som neutrofiler släpper under migration och möjliggör kvantitativ bildanalys.
Abstract
Neutrofil swarming är en samarbetsprocess genom vilken neutrofiler spärra av en infektionsplats och främja vävnad omorganisation. Swarming har klassiskt studerats in vivo i djurmodeller som visar karakteristiska mönster av cellmigration. Men in vivo modeller har flera begränsningar, inklusive intercellulära medlare som är svåra att komma åt och analysera, liksom oförmåga att direkt analysera mänskliga neutrofiler. På grund av dessa begränsningar finns det ett behov av en in vitro-plattform som studerar med mänskliga neutrofiler och ger enkel tillgång till de molekylära signaler som genereras under svärmande. Här används en multistegs mikrostämplingsprocess för att generera en biopartikelmikroarray som stimulerar svärmande genom att härma en in vivoinfektion. Biopartikelmikroarrayen inducerar neutrofiler att svära på ett kontrollerat och stabilt sätt. På mikroarrayen ökar neutrofiler i hastighet och bildar stabila svärmar runt biopartikelkluster. Dessutom analyserades supernatant som genererades av neutrofiler och 16 proteiner upptäcktes ha uttryckts differentially under svärmande. Denna in vitro-svärmande plattform underlättar direkt analys av neutrofilmigration och proteinutsläpp på ett reproducerbart, rumsligt kontrollerat sätt.
Introduction
Neutrofiler, den mest rikliga vita blodkroppar i blodomloppet1, får uppmärksamhet som potentiella diagnostiska och terapeutiska mål2,3 eftersom de kan vara inblandade i en mängd olika medicinska tillstånd inklusive gout4, sepsis3, trauma5,6, cancer1,7,8, och olika autoimmuna sjukdomar5,9. Neutrofil swarming är en flerstegs, tätt reglerad process med en komplexitet som gör det till ett särskilt intressant fokus för studie5,10,11. Under svärma, neutrofiler isolera en plats för inflammation från den omgivande friskavävnaden 5,10,11. Korrekt reglering av neutrofil swarming är viktigt att främja sårläkning och i slutändan inflammation upplösning5,12. Neutrofil swarming har främst studerats in vivo hos gnagare12,13,14,15 och zebrafiskar10,11,12,15 modeller. Men arten av dessa in vivo djurmodeller ger upphov till begränsningar5. Till exempel är de medlare som släppts av neutrofiler under svärmar inte lättillgängliga för analys5. Dessutom finns det många potentiella källor för en viss medlare in vivo, så ett in vivo-experiment måste införa en genetisk brist för att hämma cellproduktionen och/eller interaktionen för att undersöka medlarens roll i en viss process13. Ett in vitro-experiment kringgår denna komplikation genom att möjliggöra neutrofil observation utan samband med ytterligare celler. Dessutom är forskning som beskriver human neutrophil samordnad migration begränsad16. På en in vitro-svärmande plattform kan mänskliga neutrofiler analyseras direkt. En in vitro-svärmande plattform skulle kunna utveckla den kunskap som erhållits från in vivo-studier genom att ge möjligheter att fylla de luckor som finns kvar av begränsningarna i in vivo-studier.
För att ta itu med behovet av en in vitro-plattform som efterliknar in vivo neutrophil swarming, utvecklade vi en microstamping plattform som gör det möjligt för oss att mönster biopartikel mikroarrayer som stimulerar neutrofil svärmar på ett rumsligt kontrollerat sätt. Vi genererar biopartikelmikroarrayer på glasrutschbanor i en tvåstegsprocess. Först använder vi mikrostämpling för att generera en mikroarray av katjoniska polyelektrolyt (CP) fläckar. För det andra lägger vi till en lösning av biopartiklar som följer CP-fläckarna via elektrostatisk interaktion. Genom att först mönstra CP-skiktet kan vi selektivt mönster negativt laddade biopartiklar för att generera önskat neutrofils sväringsmönster. Det positivt laddade skiktet håller de negativt laddade biopartiklarna genom det kraftfulla tvättsteget som tar bort biopartiklarna från områdena på glasbilden som inte har CP. Dessutom är den CP som används här, en sampolymer av akrylamid och pittorerad katjonisk monomer, biokompatibel, så det framkallar inte ett svar från neutrofiler. Den har en mycket hög ytladdning som immobiliserar mikronstora biopartiklar till glasbilden, vilket hämmar neutrofiler från att ta bort partiklarna från den mönstrade positionen på glasbilden. Detta resulterar i biopartikelkluster ordnade i en mikroarray. När vi lade till neutrofiler i mikroarrayen bildade de stabila svärmar runt biopartikelhoparna. Genom att spåra neutrofilmigration fann vi att svärmar neutrofiler aktivt migrerar mot biopartikelklustren. Dessutom använde vi denna plattform för att analysera vissa medlare som neutrofiler släpper under svärmande. Vi hittade 16 medlare som uttrycks i differentially under uppvärmningen. Deras koncentrationer följer tre allmänna trender över tiden: ökning, minskning eller spik. Vår in vitro neutrofil swarming plattform underlättar analysen av rumsligt kontrollerad mänsklig neutrophil swarming, liksom insamling och analys av medlare släpptes av neutrofil swarming. I en tidigare publikation visade vi att patienter med vissa medicinska tillstånd (trauma, autoimmun sjukdom och sepsis), hade neutrofiler som fungerade annorlunda än de från friska donatorer5. I framtida forskningsstudier kan vår plattform användas för att analysera neutrofilfunktion bland en mängd olika patientpopulationer. Denna plattform kan kvantitativt analysera den komplexa samordning en svärmning. Ytterligare studier kan göras för att ge insikt om neutrofil funktion av en viss patientpopulation eller neutrofil svar på en patogen av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade en mikrostämplingsplattform för att generera enhetliga matriser av biopartiklar för att stimulera in vitro neutrophil swarming. In vitro karaktär vår plattform tillåter oss att kringgå de komplikationer som uppstår med in vivo sväring experiment, nämligen den dåliga förmågan att analysera medlare som släppts av svärmar neutrofiler5. Dessutom utförs in vivo-modeller vanligtvis hos gnagare11,12,<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från William G. Lowrie Institutionen för kemi och biomolekylär teknik och Comprehensive Cancer Center vid Ohio State University. Data som presenteras i denna rapport kom från bilder som bearbetas med Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) som finns på Campus Microscopy och Imaging Facility, Ohio State University. Denna anläggning stöds delvis av grant P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
