İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri
Summary
Bu protokol, mekansal olarak kontrol edilen nötrofil sürüsü sağlayan biyopartikül mikrodizileri üretir. Nötrofillerin göç sırasında serbest bırakıldığı arabuluculara kolay erişim sağlar ve nicel görüntüleme analizine olanak sağlar.
Abstract
Nötrofil sürüsü, nötrofillerin enfeksiyon bölgesini mühürlediği ve doku ların yeniden yapılandırıştırışını teşvik ettiği işbirliğine dayalı bir süreçtir. Swarming klasik hücre göç karakteristik desenleri gösteren hayvan modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, in vivo modelleri erişim ve analiz zor hücreler arası arabulucuları da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar var, yanı sıra doğrudan insan nötrofiller analiz etmek için yetersizlik. Bu sınırlamalar nedeniyle, insan nötrofilleri ile dolu çalışmalar ve swarming sırasında üretilen moleküler sinyallere kolay erişim sağlayan bir in vitro platform için bir ihtiyaç vardır. Burada, çok aşamalı bir mikrodamgalama işlemi in vivo enfeksiyon taklit ederek sürü uyarır bir biyopartikül mikrodizi oluşturmak için kullanılır. Biyopartikül mikrodizi nötrofillerin kontrollü ve istikrarlı bir şekilde akın etmesini sağlar. Mikrodizide nötrofiller hızlarını arttırır ve biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluştururlar. Ayrıca nötrofiller tarafından üretilen süpernatant analiz edildi ve 16 proteinin sürü boyunca farklı olarak ifade edildiği keşfedildi. Bu in vitro swarming platformu tekrarlanabilir, mekansal kontrollü bir şekilde nötrofil göçü ve protein salınımı doğrudan analizini kolaylaştırır.
Introduction
Nötrofiller, kan dolaşımında en bol beyaz kan hücresi1, potansiyel tanı ve tedavi hedefleri olarak dikkat kazanıyor2,3 gut dahil olmak üzere tıbbi koşulların çeşitli dahil olabilir çünkü4, sepsis3, travma5,6, kanser1,7,8, ve çeşitli otoimmün hastalıklar5,9. Nötrofil sürüsü çok aşamalı, sıkı bir süreç çalışma5,10,11özellikle ilginç bir odak yapan bir karmaşıklık ile düzenlenmiştir. Swarming sırasında, nötrofiller çevreleyen sağlıklı doku5,10,11inflamasyon bir site izole . Nötrofil swarming uygun düzenleme yara iyileşmesi ve sonuçta inflamasyon çözünürlükteşviketmek esastır5 ,12. Nötrofil sürüsü öncelikle kemirgen12, 13,14,15 ve zebra balığı10,11,12,15 modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, bu in vivo hayvan modellerinin doğası sınırlamalar doğuracak5. Örneğin, swarming sırasında nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz5için kolayca erişilebilir değildir. Ayrıca, vivo belirli bir arabulucu için birçok potansiyel kaynaklar vardır, bu nedenle bir in vivo deney belirli bir süreç içinde bu arabulucu rolünü araştırmak için hücresel üretim ve / veya etkileşimi inhibe etmek için genetik bir eksiklik tanıtmak gerekir13. Bir in vitro deney ek hücreler bağlamı olmadan nötrofil gözlem sağlayarak bu komplikasyonu atlatır. Ayrıca, insan nötrofil koordine göç açıklayan araştırma sınırlıdır16. Bir in vitro swarming platformunda, insan nötrofiller doğrudan analiz edilebilir. In vitro swarming platformu in vivo çalışmaların sınırlamaları tarafından bırakılan boşlukları doldurmak için fırsatlar sağlayarak in vivo çalışmalardan elde edilen bilgi üzerine genişletebilir.
In vivo nötrofil sürüsünün imi olan bir in vitro platformihtiyacını gidermek için, nötrofil insidansını mekansal olarak kontrol edilen bir şekilde uyaran biyopartikül mikrodizimlerini desenlememizi sağlayan bir mikrodamgalama platformu geliştirdik. İki aşamalı bir süreçte cam slaytlarda biyopartikül mikrodizileri üretiyoruz. İlk olarak, katyonik polielektrolit (CP) noktalar bir mikrodizi oluşturmak için mikrodamgalama kullanın. İkinci olarak, elektrostatik etkileşim yoluyla CP noktalarına yapışan biyopartiküllerin bir çözeltisi ekliyoruz. Cp tabakasını ilk desenlendirerek, negatif yüklü biyopartikülleri istenilen nötrofil swarming deseni oluşturmak için seçici olarak desenleyebiliriz. Pozitif yüklü tabaka CP yok cam slayt alanlarından biyopartikülleri kaldırır güçlü yıkama adımı ile negatif yüklü biyopartiküller tutar. Ayrıca, CP burada kullanılan, akrilamid ve kuaternif katyonik monomer bir kopolimer, biyouyumlu, bu yüzden nötrofiller bir yanıt neden olmaz. Mikron büyüklüğündeki biyopartikülleri cam kaydırağa immobilize eden çok yüksek bir yüzey yüküne sahiptir, böylece nötrofillerin cam kaydıraktan parçacıkları çıkarmalarını engeller. Bu da mikrodizi halinde düzenlenmiş biyopartikül kümeleri ile sonuçlanır. Nötrofilleri mikrodiziye eklediğimizde, biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluşturdular. Nötrofil göçlerini takip ederek, kalabalık nötrofillerin aktif olarak biyopartikül kümelerine doğru göç ettiğini bulduk. Ayrıca, bu platformu nötrofillerin sürü sırasında serbest bırakan bazı aracıları analiz etmek için kullandık. Swarming sırasında farklı bir şekilde ifade edilen 16 arabulucu bulduk. Konsantrasyonları zaman içinde üç genel eğilimleri takip: artış, azalma veya başak. İn vitro nötrofil swarming platformumuz, nötrofil swarming tarafından salınan arabulucuların toplanması ve analizinin yanı sıra mekansal olarak kontrol edilen insan nötrofil sürülerinin analizini de kolaylaştırır. Bir önceki yayında, belirli tıbbi durumları olan hastaların (travma, otoimmün hastalık ve sepsis) sağlıklı donörlerden farklı işlev gören nötrofiller olduğunu gösterdik5. Gelecekteki araştırmalarda, platformumuz çeşitli hasta popülasyonları arasında nötrofil fonksiyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bu platform nötrofil sürüsünde yer alan karmaşık koordinasyonu nicel olarak analiz edebilir. Ek çalışmalar belirli bir hasta popülasyonunun nötrofil fonksiyonu veya ilgi bir patojen nötrofil yanıt hakkında fikir sağlamak için yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İn vitro nötrofil sürüsünün uyarması için tek tip biyopartikül dizileri oluşturmak için bir mikro damgalama platformu geliştirdik. Platformumuzun in vitro doğası bize in vivo swarming deneyler, yani swarming nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz etmek için kötü yeteneği ile ortaya çıkan komplikasyonlar atlatmak için izin verir5. Ayrıca, in vivo modelleri genellikle kemirgenler11,12,<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma William G. Lowrie Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü ve Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi’nin finansmanı ile desteklenmiştir. Bu raporda sunulan veriler, Ohio State Üniversitesi Kampüs Mikroskobu ve Görüntüleme Tesisi’nde bulunan Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) kullanılarak işlenen görüntülerden elde edilmiştir. Bu tesis kısmen P30 CA016058, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
