Здесь мы предоставили метод для достижения стабильной трансфекции куриных паразитов Эймерии нуклеэктингом спорозоитов или мерозоитов второго поколения. Генетически модифицированные эймерийские паразиты, выражающие гетерологические антигенные гены, могут быть использованы в качестве средств доставки вакцин.
Трансфекция является техническим процессом, с помощью которого генетический материал, такой как ДНК и двухцепочечная РНК, поставляются в клетки для изменения гена, представляющего интерес. В настоящее время трансгенная технология становится незаменимым инструментом для изучения Эймерии,возбудительов кокцидиоза у птицы и скота. Этот протокол содержит подробное описание стабильной трансфекции у эймерских паразитов: очищение и нуклеофеирование спорозоитов или мерозоитов второго поколения, а также виво-распространение транс-инфицированных паразитов. Используя этот протокол, мы достигли трансфекции в нескольких видах Эймерии. В совокупности нуклеофикция является полезным инструментом для облегчения генетических манипуляций с эймерскими паразитами.
Eimeria spp. вызывает кокцидиоз, что приводит к значительным экономическим потерям в животноводстве и птицеводстве. Хотя антикоккидные препараты, и в определенной степени, ослабленные антикокцидиальные вакцины, были широко использованы для контроля кокцидиоза, Есть еще недостатки в отношении их лекарственной устойчивости, остатков наркотиков, а также потенциальное распространение вакцин штаммов, которые восстанавливают вирулентность1. С развитием молекулярной биологии, трансфекция стала жизненно важным инструментом для изучения функций генов, разработки новых вакцин, а также скрининга новых целей наркотиков для Эймерии.
В последние десятилетия, трансфекция была успешно применена для апикомплексных паразитов, таких как Plasmodium и Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Исследование с использованием З-гал в качестве репортера для трансфекции в E. tenella пилотировал такую работу в Эймерии7. Трансфекция E. tenella8,9, E. mitis10, и E. acervulina (Чжан и др., неопубликованные данные) была успешной в кур. Недавно мы достигли трансфекции с использованием мерозоитов E. necatrix через нуклеофэкцию11.
Исследования показали, что Eimeria, выражающая гетерологический антиген, имеет потенциал для разработки в качестве рекомбинантной вакцины, например, тех, кто выражает Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) или куриный интерлейкин 2 (chIL-2)12,13. Таким образом, этот протокол описывает нуклеофэкционное исследование Eimeria spp. у кур. Процедура описывает очищение спорозоитов или мерозоитов, нуклеофекцию с плазмидной ДНК, клоакальной прививки/внутривенную инъекцию и распространение виво, чтобы помочь исследователям начать исследования трансгенных паразитов Эймерии.
В 1990-х годах была разработана трансфекционная система для паразитов-апикомплексных, и она использовалась для исследований эймерских паразитов. Недавно, стабильная трансфекция была проведена в E. tenella8,9 и E. nieschulzi15. Мы достигли стабил…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFD0501200) и Национальным фондом естественных наук Китая (31572507, 31772728 и 31873007).
ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
DMEM | MACGENE | CM15019 | |
Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
Glucose | Sigma | No. V900116 | |
Glycine | Biotopped | G6200 | |
HBSS | MACGENE | CC016 | |
KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
MgCl2 | Sigma | 449164 | |
MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
PBS | Solarbio | P1010 | |
Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
Trypsin | Solarbio | T8150 | |
Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |