النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج
Summary
هنا ، قدمنا طريقة لتحقيق الترانفيس المستقر لطفيليات الأيفريا الدجاج من قبل النيوليوبوكتينغ سبوروزويبس أو الجيل الثاني merozoites. ويمكن استخدام الطفيليات الأيميرية المعدلة وراثياً التي تعبر عن الجينات المغايرة للجينات المغايرة كوسائل لإيصال اللقاح.
Abstract
Transfection هو عملية تقنية يتم من خلالها تسليم المواد الوراثية ، مثل الحمض النووي الحمض النووي والحمض النووي الريبي المزدوج ، إلى خلايا لتعديل الجين ذي الاهتمام. حاليا، والتكنولوجيا المعدلة وراثيا أصبحت أداة لا غنى عنها لدراسة Eimeria،العوامل المسببة للcoccidiosis في الدواجن والماشية. يقدم هذا البروتوكول وصفًا مفصلًا للترانسفيكتيون المستقر في الطفيليات الإميرية: تنقية ونواة من السبوروزوبيت أو الميروزويت من الجيل الثاني ، وفي انتشار الطفيليات العابرة للفيروس. باستخدام هذا البروتوكول، حققنا transfection في عدة أنواع من Eimeria. إذا ما أُخذت هذه النواة معاً، فهي أداة مفيدة لتسهيل التلاعب الجيني في الطفيليات الأيميرية.
Introduction
تسبب Eimeria spp. الديوك، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية كبيرة في صناعة الماشية والدواجن. على الرغم من أن الأدوية المضادة للأكسيد ، وإلى حد ما ، اللقاحات المضادة للأكسيد ، قد استخدمت على نطاق واسع للسيطرة على الديوكديوسيس ، لا تزال هناك أوجه قصور فيما يتعلق بمقاومتها للأدوية ، ومخلفات الأدوية ، والانتشار المحتمل لسلالات اللقاحات التي تستعيد الفوعة1. مع تطور البيولوجيا الجزيئية ، أصبح الترانزفيشن أداة حيوية لدراسة وظائف الجينات ، وتطوير لقاحات جديدة ، وفحص أهداف الأدوية الجديدة لEimeria.
في العقود الأخيرة ، تم تطبيق الترانفيشن بنجاح لطفيليات apicomplexan مثل Plasmodium و Toxoplasma gondii2،3،4،5،6. دراسة باستخدام α-غال كمراسل للترانزفيشن في E. tenella تجريب مثل هذا العمل في Eimeria7. وكان transfection من E. tenella8،9، E. mitis10، وE. acervulina (تشانغ وآخرون ، والبيانات غير المنشورة) ناجحة في الدجاج. في الآونة الأخيرة ، حققنا transfection باستخدام merozoites من E. necatrix من خلال nucleofection11.
وأظهرت الدراسات أن Eimeria التعبير عن مستضد التغاير لديه القدرة على أن يتم تطويرها كلقاح المؤتلف، مثل تلك التي تعبر عن Campylobacter jejuni مستضد A (CjaA) أو إنترلوكين الدجاج 2 (chIL-2)12،13. لذلك ، يصف هذا البروتوكول دراسة النواة من Eimeria spp. في الدجاج. يصف الإجراء تنقية sporozoites أو merozoites ، النيوكليوفيكتيون مع الحمض النووي البلازميد ، التطعيم الكلوكال / الحقن الوريدي وفي الانتشار في الجسم الحي لمساعدة الباحثين على بدء دراسات على طفيليات إيميريا المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في التسعينيات ، تم تطوير نظام نقل للطفيليات المعقدة ، وتم استخدامه لإجراء دراسات على الطفيليات الإميرية. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء transfection مستقرة في E. tenella8،9 و E. nieschulzi15. حققنا الترانزفيشن مستقرة من E. necatrix عن طريق transfecting الجيل ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFD0501200) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31572507 و 31772728 و 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
