Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation
Summary
Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.
Abstract
Transfeksiyon, DNA ve çift iplikli RNA gibi genetik materyalin ilgi genini değiştirmek için hücrelere teslim edildiği teknik bir süreçtir. Şu anda, transgenik teknoloji Eimeriaçalışma için vazgeçilmez bir araç haline geliyor , kümes hayvanları ve hayvancılık koksidoz nedensel ajanlar. Bu protokol eimerian parazitlerde kararlı transfeksiyonun ayrıntılı bir tanımını sağlar: sporozoitlerin veya ikinci nesil merozitlerin saflaştırılması ve nükleofeslenmesi ve transfected parazitlerin in vivo yayılımı. Bu protokolü kullanarak, Eimeriaçeşitli türlerde transfection elde etti. Birlikte ele alındığında, nükleofection eimerian parazitlerde genetik manipülasyon kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.
Introduction
Eimeria spp. koksidoza neden olur ve bu da hayvancılık ve kümes hayvanları endüstrisinde önemli ekonomik kayıplara yol açar. Antikokokidiyal ilaçlar, ve bir ölçüde, zayıflatılmış antikokokidiyal aşılar, coccidiosis kontrolü için yaygın olarak kullanılmaktadır rağmen, hala onların ilaç direnci ile ilgili eksiklikler vardır, ilaç artıkları, ve virülans yeniden aşı suşlarının potansiyel difüzyon1. Moleküler biyolojinin gelişmesiyle transfeksiyon, gen fonksiyonlarını incelemek, yeni aşılar geliştirmek ve Eimeriaiçin yeni ilaç hedeflerinitleme için hayati bir araç haline gelmiştir.
Son yıllarda, transfeksiyon plazmodium ve Toxoplasma gondii2,3,4,5,6gibi apicomplexan parazitler için başarıyla uygulanmıştır. E. tenella transfection için bir muhabir olarak β-gal kullanarak bir çalışma Eimeria7gibi çalışma pilot . E. tenella8transfeksiyon ,9, E. mitis10, ve E. acervulina (Zhang ve ark., yayınlanmamış veri) tavukbaşarılı oldu. Son zamanlarda, biz nükleofection11ile E. necatrix merozoitler kullanarak transfeksiyon elde etti.
Çalışmalar eimeria heterolog antijen ifade bir rekombinant aşı olarak geliştirilebilir potansiyeline sahip olduğunu gösterdi, bu campylobacter jejuni antijen A ifade gibi (CjaA) veya tavuk interlökin 2 (chIL-2)12,13. Bu nedenle, bu protokol tavuklarda Eimeria spp. bir nükleofection çalışma açıklar. Prosedür, sporozoitlerin veya merozoitlerin saflaştırılmasını, plazmid DNA ile nükleofeksiyonu, kloakal aşılama/intravenöz enjeksiyonu ve araştırmacıların transgenik Eimeria parazitleri üzerinde çalışmalara başlamalarına yardımcı olmak için in vivo yayılımı tanımlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
1990’larda apikompleks parazitler için bir transfeksiyon sistemi geliştirilmiş ve eimerian parazitler üzerinde çalışmalarda kullanılmıştır. Son zamanlarda, kararlı transfeksiyon E. tenella8yapıldı ,9 ve E. nieschulzi15. İkinci nesil merozoitler 11’i dönüştürerek E. necatrix’in kararlı transfeksiyonuna ulaştık. E. acervulina transfected sporozoitlerin kanat da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFD0501200) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31572507, 31772728 ve 31873007) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
