Purification de la prominine-1- Cellules souches de Cerebellum souris postnatale
Summary
Démontré ici est une méthode efficace et rentable pour purifier, la culture, et différencier les cellules souches de matière blanche du cervelet de souris postnatale.
Abstract
La plupart des neurones cérébellaires proviennent de deux niches souches embryonnaires : une niche rhombique pour les lèvres, qui génère tous les neurones glutamatergiques excitatoires cérélotés, et une niche de zone ventriculaire, qui génère les cellules inhibitrices de Purkinje GABAergic, qui sont des neurones qui constituent les noyaux cérébellaires profonds et les gliax de Bergman. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite qui se présente comme une zone germinale secondaire de la niche de zone ventriculaire. Les cellules de cette niche sont définies par le marqueur de surface cellulaire prominin-1 et sont localisées à la matière blanche en développement du cervelet postnatal. Ce créneau explique la couche moléculaire défunte GABAergic interneurons avec les astrocytes cérébellaires générés par la postnaline. En plus de leur rôle de développement, ce créneau gagne en importance translationnelle en ce qui concerne son implication dans la neurodégénérescence et la tumorigenesis. La biologie de ces cellules a été difficile à déchiffrer en raison d’un manque de techniques efficaces pour leur purification. Les méthodes efficaces pour purifier, culture et différencier ces cellules souches cérébellaires postnatales sont démontrées ici.
Introduction
Le cervelet a longtemps été reconnu comme un circuit neuronal majeur coordonnant le mouvement volontaire1. Il reçoit l’apport des larges pans des neuroaxis, qui comprend des informations proprioceptives de la périphérie, afin de régler finement la sortie du moteur et coordonner le mouvement. Plus récemment, il a également été impliqué dans la régulation de la cognition et des émotions en utilisant potentiellement des réseaux similaires de traitement de l’information2,3,4.
Le cervelet adulte est composé d’un cortex cérébellaire externe et de matière blanche intérieure. Entrecoupés dans ces structures sont des noyaux intracerebellaires profonds. Semblable au reste du système nerveux, le développement du cervelet est entraîné par la prolifération des cellules progénitrices multipotentes (cellules souches) qui migrent et se différencient pour donner cette structure bien organisée. Dans le développement précoce (E10.5-E13.5), une niche de tige ventriculaire autour du quatrième ventricule en développement génère des neurones GABAergic (c.-à-d. cellules Purkinje, cellules Lugaro, cellules Golgi) avec Bergmann glia5,6,7,8.
Plus tard dans le développement (semaine postnatale un), une deuxième niche de cellules souches dans la lèvre rhombique génère MATH1- et Nestin-exprimant les ancêtres qui donnent lieu à des neurones granule excitatoires9,10,11,12. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite13. Ces cellules expriment la prominine-1 (également connu sous le nom de CD133), une glycoprotéine couvrant la membrane qui définit un sous-ensemble de cellules souches dans l’intestin et les systèmes hématopoïétiques14,15,16. La cartographie du destin in vivo montre que ces cellules souches génèrent des interneurons de couches moléculaires clés (c.-à-d. les cellules de panier et les cellules de stellate), ainsi que les astrocytes, pendant les trois premières semaines postnatales. Dans le passé, il a été difficile d’étudier ces cellules in vitro parce que les méthodes antérieures ont exigé des techniques coûteuses et chronophages (c.-à-d., le tri cellulaire activé par la fluorescence [FACS]) qui dépendent de la coloration de prominine-112,13,17. Ce protocole décrit une méthode immunomagnétique-basée pour l’isolement de ces cellules souches qui peuvent alors être facilement cultivées et différenciées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules souches cérébellaires prominin-1-exprimant résident dans la matière blanche prospective pendant les 3 premières semaines de la vie postnatale. Leur prolifération est étroitement contrôlée par la voie sonore hérisson soutenu par les cellules Purkinje17. Ces cellules souches/progéniteurs contribuent à des interneurons GABAergic nés plus tard appelés cellules de panier et cellules de stellate. Ces interneurons résident dans la couche moléculaire, où ils synapse sur les c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Opal pour leurs suggestions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH 1RO1 NS062051 et 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neurosciences. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologie du développement. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
