Rening av Prominin-1+ stamceller från Postnatal Mus Cerebellum
Summary
Demonstreras här är en effektiv och kostnadseffektiv metod för att rena, odla och skilja vit materia stamceller från postnatalmus lillhjärnan.
Abstract
De flesta cerebellar nervceller uppstår från två embryonala stam nischer: en rombisk läpp nisch, som genererar alla cerebellar excitatoriska glutamatergic nervceller, och en ventrikulär zon nisch, som genererar hämmande GABAergic Purkinje celler, som är nervceller som utgör den djupa cerebellar kärnor och Bergman glia. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits som uppstår som en sekundär germinal zon från ventrikulära zonen nisch. Cellerna i denna nisch definieras av cellytan markör prominin-1 och är lokaliserade till den växande vita frågan av postnatala lillhjärnan. Denna nisch står för den sena födda molekylära skiktet GABAergic interneurons tillsammans med postnatally genererade cerebellar astrocyter. Förutom deras utvecklingsmässiga roll, denna nisch vinner translationell betydelse när det gäller dess engagemang i neurodegeneration och tumorigenesis. Biologin hos dessa celler har varit svår att dechiffrera på grund av brist på effektiva tekniker för deras rening. Demonstreras här är effektiva metoder för att rena, kultur och differentiera dessa postnatala cerebellar stamceller.
Introduction
Lillhjärnan har länge erkänts som en stor neuronal krets samordna frivillig rörelse1. Den får indata från de breda strängarna av neuroaxis, som innehåller proprioceptive information från periferin, för att finjustera motoreffekt och samordna rörelse. På senare tid har det också varit inblandad i regleringen av kognition och känslor genom att eventuellt använda liknande nätverk för informationsbehandling2,3,4.
Den vuxna lillhjärnan består av en yttre cerebellar cortex och inre vit materia. Interspersed inom dessa strukturer är djupa intracerebellar kärnor. I likhet med resten av nervsystemet drivs utvecklingen av lillhjärnan av spridningen av multipotenta stamceller (stamceller) som migrerar och differentierar för att ge denna välorganiserade struktur. I tidig utveckling (E10.5–E13.5), en ventrikulär stam nisch runt den växande fjärde ventrikeln genererar GABAergic nervceller (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) tillsammans med Bergmann glia5,6,7,8.
Senare i utvecklingen (postnatal vecka ett), en andra stamceller nisch i den rombiska läppen genererar MATH1- och Nestin-uttrycker förfäder som ger upphov till excitatoriska granulat nervceller9,10,11,12. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits13. Dessa celler uttrycker prominin-1 (även känd som CD133), ett membran-spänner glykoprotein som definierar en delmängd av stamceller i tarmen och hematopoietiska system14,15,16. In vivo öde kartläggning visar att dessa stamceller genererar viktiga molekylära lager interneurons (dvs. korgceller och stellate celler), tillsammans med astrocyter, under de första tre postnatala veckorna. Tidigare har det varit svårt att studera dessa celler in vitro eftersom tidigare metoder har krävt kostsamma och tidskrävande tekniker (dvs. fluorescensaktiverad cellsortering [FACS]) som är beroende av prominin-1 färgning12,13,17. Detta protokoll beskriver en immunomagnetisk-baserad metod för isolering av dessa stamceller som sedan lätt kan odlas och differentieras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-uttrycker cerebellar stamceller bor i den potentiella vita frågan under de första 3 veckorna av postnatala liv. Deras spridning är hårt kontrollerad av sonic igelkott väg stöds av Purkinje celler17. Dessa stamceller/stamfater bidrar till senare födda GABAergic interneurons som kallas korgceller och stellateceller. Dessa interneurons bor i det molekylära lagret, där de synaps på Purkinje celler och skulptera PC topografi och funktion via GABAergic hämning13</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Opal lab medlemmar för deras förslag. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag 1RO1 NS062051 och 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neurosciences. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Biologie du développement. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
