Utilisation de l’analogue de la pyrimidine, la 5-iod-2′-désoxyuridine (IdU) avec des marqueurs du cycle cellulaire pour établir les phases du cycle cellulaire dans une plateforme de cytométrie de masse
Summary
Ce protocole adapte les mesures du cycle cellulaire pour une utilisation dans une plateforme de cytométrie de masse. Grâce aux capacités multiparamétriques de la cytométrie de masse, la mesure directe de l’incorporation d’iode permet l’identification des cellules en phase S, tandis que les marqueurs du cycle intracellulaire permettent de caractériser chaque état du cycle cellulaire dans une gamme de conditions expérimentales.
Abstract
La régulation de la phase du cycle cellulaire est un aspect important de la prolifération cellulaire et de l’homéostasie. La perturbation des mécanismes de régulation régissant le cycle cellulaire est une caractéristique d’un certain nombre de maladies, y compris le cancer. L’étude du cycle cellulaire nécessite la capacité de définir le nombre de cellules dans chaque partie de la progression du cycle cellulaire ainsi que de délimiter clairement chaque phase du cycle cellulaire. L’avènement de la cytométrie de masse (MCM) offre un potentiel énorme pour l’analyse unicellulaire à haut débit grâce à des mesures directes des isotopes élémentaires, et le développement d’une méthode pour mesurer l’état du cycle cellulaire par MCM étend encore l’utilité de MCM. Nous décrivons ici une méthode qui mesure directement la 5-iode-2′-désoxyuridine (IdU), similaire à la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU), dans un système MCM. L’utilisation de ce MCM basé sur IdU offre plusieurs avantages. Tout d’abord, l’IdU est rapidement incorporé dans l’ADN au cours de sa synthèse, ce qui permet une mesure fiable des cellules en phase S avec des incubations aussi courtes que 10-15 minutes. Deuxièmement, l’IdU est mesurée sans avoir besoin d’anticorps secondaires ou de dégradation de l’ADN. Troisièmement, la coloration de l’IdU peut être facilement combinée avec la mesure de la cycline B1, de la protéine du rétinoblastome phosphorylé (pRb) et de l’histone phosphorylée H3 (pHH3), qui fournissent collectivement une délimitation claire des cinq phases du cycle cellulaire. La combinaison de ces marqueurs de cycle cellulaire avec le nombre élevé de paramètres possibles avec MCM permet la combinaison avec de nombreuses autres métriques.
Introduction
La cytométrie de masse permet la détection d’environ 40 paramètres en tirant parti de la haute résolution et de la nature quantitative de la spectroscopie de masse. Les anticorps marqués au métal sont utilisés à la place des anticorps conjugués fluorophores qui permettent un plus grand nombre de canaux et produisent un débordement minimal 1,2. MCM présente des avantages et des inconvénients en ce qui concerne l’analyse du cycle cellulaire par rapport à la cytométrie en flux. L’un des principaux avantages de la MCM est que le grand nombre de paramètres permet la mesure simultanée de l’état du cycle cellulaire sur un grand nombre de types de lymphocytes T immunophénotypiquement distincts dans des échantillons très hétérogènes. MCM a été utilisé avec succès pour mesurer l’état du cycle cellulaire pendant l’hématopoïèse normale dans la moelle osseuse humaine3 et les modèles murins transgéniques de déficit en télomérase4. L’analyse de l’état du cycle cellulaire dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) a montré que le cycle cellulaire était corrélé aux réponses connues aux thérapies cliniques, fournissant un aperçu in vivo des caractéristiques fonctionnelles qui peuvent éclairer les choix de traitement5. Un deuxième avantage de l’analyse du cycle cellulaire cytométrique de masse est la capacité de mesurer un grand nombre d’autres marqueurs fonctionnels qui peuvent être corrélés avec l’état du cycle cellulaire. Des travaux récents ont permis de corréler la synthèse des protéines et de l’ARN avec l’état du cycle cellulaire grâce à l’utilisation d’anticorps IdU et d’anticorps marqués par des métaux dirigés contre BRU et l’ARNr6. Ce type d’analyse hautement paramétrique mesurant l’état du cycle cellulaire dans de nombreuses populations dans un continuum de différenciation serait presque impossible avec la technologie actuelle de cytométrie en flux. Le principal inconvénient de la MCM est l’absence de colorations d’ADN ou d’ARN comparables à celles utilisées en cytométrie en flux fluorescent (par exemple, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Les colorants fluorescents peuvent donner des mesures relativement précises de la teneur en ADN et en ARN, mais cette précision n’est possible qu’en raison des changements dans les propriétés fluorescentes de ces colorants qui se produisent lors de l’intercalation entre les bases nucléotidiques. L’analyse MCM est donc incapable de mesurer la teneur en ADN ou en ARN avec une précision similaire. Au lieu de cela, l’analyse du cycle cellulaire cytométrique de masse repose sur des mesures de protéines liées à l’état du cycle cellulaire telles que la cycline B1, la protéine du rétinoblastome phosphorylé (pRb) et l’histone phosphorylée H3 (pHH3) combinées à la mesure directe de l’atome d’iode provenant de l’incorporation d’IdU dans les cellules en phase S. Ces deux approches de mesure donnent des résultats très similaires pendant la prolifération cellulaire normale, mais peuvent potentiellement être discordantes lorsque la progression du cycle cellulaire est perturbée.
La mesure du nombre de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire est importante pour comprendre le développement normal du cycle cellulaire ainsi que la perturbation du cycle cellulaire, ce qui est couramment observé dans les cancers et les maladies immunologiques. MCM fournit une mesure fiable des facteurs extracellulaires et intracellulaires à l’aide d’anticorps marqués par des métaux; cependant, la mesure de la phase S était limitée car l’intercalateur d’ADN à base d’iridium était incapable de différencier l’ADN 2N et 4N. Afin de définir les phases du cycle cellulaire, Behbehani a développé une méthode qui utilise l’IdU avec une masse de 127, ce qui se situe dans la plage du cytomètre de masse et permet une mesure directe des cellules en phase S3. Cette mesure directe contourne le besoin d’anticorps secondaires ou l’utilisation d’agents dénaturants de l’ADN tels que l’acide ou la DNase. En conjonction avec les marqueurs de cycle intracellulaire, il permet une haute résolution de la distribution du cycle cellulaire dans des modèles expérimentaux.
Ce protocole adapte les mesures du cycle cellulaire à partir des protocoles courants de cytométrie en flux pour MCM. Nos méthodes fournissent un moyen pratique et simple d’inclure des paramètres de cycle cellulaire. L’incorporation d’échantillons in vitro par IdU ne nécessite que 10 à 15 minutes d’incubation à 37 °C, ce qui est plus court que la plupart des protocoles de coloration BrdU qui recommandent des temps d’incubation de plusieurs heures 3,7. Les échantillons incorporés d’IdU et de BrdU peuvent être fixés à l’aide d’un stabilisateur protéomique, puis conservés pendant un certain temps dans un congélateur à -80 °C. Cela permet d’archiver un grand nombre d’échantillons colorés IdU pour analyse par lots sans réduction de la qualité des échantillons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les exemples présentés ici montrent comment utiliser une plateforme MCM pour analyser la distribution du cycle cellulaire. Il a également été démontré que l’analyse du cycle cellulaire est sensible aux conditions expérimentales telles que le temps et la température, ce qui est une considération importante que les chercheurs doivent prendre en compte lorsqu’ils envisagent la MCM pour leur analyse du cycle cellulaire14. Les échantillons laissés entreposés pendant une courte période…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang et Justin Lyeberger pour leur soutien expérimental. Ce travail a été soutenu par le programme de bourses Pelotonia Fellowship. Toutes les opinions, constatations et conclusions exprimées dans ce document sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement celles du programme de bourses Pelotonia Fellowship.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
