मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में सेल चक्र चरणस्थापित करने के लिए सेल चक्र मार्करों के साथ पाइरिमिडीन एनालॉग, 5-आयोडो-2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (आईडीयू) का उपयोग
Summary
यह प्रोटोकॉल मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में उपयोग के लिए सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। मास साइटोमेट्री की बहु-पैरामीटर क्षमताओं के साथ, आयोडीन निगमन का प्रत्यक्ष माप एस-चरण में कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है जबकि इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्कर प्रयोगात्मक स्थितियों की एक श्रृंखला में प्रत्येक सेल चक्र अवस्था के लक्षण वर्णन को सक्षम करते हैं।
Abstract
सेल चक्र चरण का विनियमन सेलुलर प्रसार और होमियोस्टैसिस का एक महत्वपूर्ण पहलू है। कोशिका चक्र को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्र का विघटन कैंसर सहित कई बीमारियों की एक विशेषता है। सेल चक्र के अध्ययन के लिए सेल चक्र प्रगति के प्रत्येक भाग में कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करने के साथ-साथ प्रत्येक सेल चक्र चरण के बीच स्पष्ट रूप से चित्रित करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। मास साइटोमेट्री (एमसीएम) का आगमन मौलिक आइसोटोप के प्रत्यक्ष माप के माध्यम से उच्च थ्रूपुट एकल कोशिका विश्लेषण के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करता है, और एमसीएम द्वारा सेल चक्र स्थिति को मापने के लिए एक विधि का विकास एमसीएम की उपयोगिता को और बढ़ाता है। यहां हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो सीधे एमसीएम प्रणाली में 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू) के समान 5-आयोडो-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (आईडीयू) को मापता है। इस आईडीयू-आधारित एमसीएम का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, आईडीयू को इसके संश्लेषण के दौरान डीएनए में तेजी से शामिल किया जाता है, जिससे एस-चरण में कोशिकाओं के विश्वसनीय माप की अनुमति मिलती है, जिसमें 10-15 मिनट तक ऊष्मायन होता है। दूसरा, आईडीयू को द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता या डीएनए क्षरण की आवश्यकता के बिना मापा जाता है। तीसरा, आईडीयू धुंधला पन को साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (आरबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) के माप के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है, जो सामूहिक रूप से पांच सेल चक्र चरणों का स्पष्ट चित्रण प्रदान करता है। एमसीएम के साथ संभव मापदंडों की उच्च संख्या के साथ इन सेल चक्र मार्करों का संयोजन कई अन्य मैट्रिक्स के साथ संयोजन की अनुमति देता है।
Introduction
मास साइटोमेट्री मास स्पेक्ट्रोस्कोपी के उच्च रिज़ॉल्यूशन और मात्रात्मक प्रकृति का लाभ उठाकर लगभग 40 मापदंडों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। फ्लोरोफोर संयुग्मित एंटीबॉडी के बजाय धातु-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है जो अधिक संख्या में चैनलों की अनुमति देते हैं और न्यूनतम स्पिलओवर 1,2 का उत्पादन करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में सेल चक्र विश्लेषण के संबंध में एमसीएम के फायदे और नुकसान हैं। एमसीएम का एक प्रमुख लाभ यह है कि बड़ी संख्या में पैरामीटर अत्यधिक विषम नमूनों में बड़ी संख्या में इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से अलग टी-सेल प्रकारों में सेल चक्र स्थिति के एक साथ माप को सक्षम बनाते हैं। एमसीएम का उपयोग मानव अस्थि मज्जा 3 में सामान्य हेमटोपोइजिस और टेलोमेरेज़ की कमीके ट्रांसजेनिक मुराइन मॉडल के दौरान कोशिका चक्र की स्थिति को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गयाहै। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में सेल चक्र की स्थिति के विश्लेषण से पता चला है कि सेल चक्र नैदानिक उपचारों के लिए ज्ञात प्रतिक्रियाओं से संबंधित है, कार्यात्मक विशेषताओं में एक इनविवो अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो चिकित्सा चयनको सूचित कर सकता है। मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण का दूसरा लाभ बड़ी संख्या में अन्य कार्यात्मक मार्करों को मापने की क्षमता है जो सेल चक्र स्थिति के साथ सहसंबद्ध हो सकते हैं। हाल के काम में आईडीयू और धातु टैग किए गए एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से सेल चक्र अवस्था के साथ प्रोटीन और आरएनए संश्लेषण को सहसंबंधित करने में सक्षम किया गयाहै। भेदभाव की निरंतरता में कई आबादी में सेल चक्र की स्थिति को मापने वाला इस तरह का अत्यधिक पैरामीट्रिक विश्लेषण वर्तमान प्रवाह साइटोमेट्री तकनीक के साथ लगभग असंभव होगा। एमसीएम का प्रमुख नुकसान फ्लोरोसेंट फ्लो साइटोमेट्री (जैसे, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, आदि) में उपयोग किए जाने वाले तुलनीय डीएनए या आरएनए दाग की कमी है। फ्लोरोसेंट रंजक डीएनए और आरएनए सामग्री के अपेक्षाकृत सटीक माप दे सकते हैं, लेकिन यह परिशुद्धता केवल इन रंगों के फ्लोरोसेंट गुणों में परिवर्तन के कारण संभव है जो न्यूक्लियोटाइड बेस के बीच इंटरकेलेशन पर होते हैं। एमसीएम विश्लेषण इस प्रकार समान परिशुद्धता के साथ डीएनए या आरएनए सामग्री को मापने में असमर्थ है। इसके बजाय, मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण सेल चक्र अवस्था से संबंधित प्रोटीन के माप पर निर्भर करता है जैसे साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (पीबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) आईडीयू निगमन से आयोडीन परमाणु के प्रत्यक्ष माप के साथ संयुक्त एस-चरण कोशिकाओं में। ये दो माप दृष्टिकोण सामान्य सेलुलर प्रसार के दौरान अत्यधिक समान परिणाम देते हैं, लेकिन सेल चक्र की प्रगति बाधित होने पर संभावित रूप से अलग हो सकते हैं।
प्रत्येक सेल चक्र चरण में कोशिकाओं की संख्या का मापन सामान्य सेल चक्र विकास के साथ-साथ सेल चक्र व्यवधान को समझने में महत्वपूर्ण है, जो आमतौर पर कैंसर और प्रतिरक्षाविज्ञानी रोगों में देखा जाता है। एमसीएम धातु-टैग किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके बाह्य और इंट्रासेल्युलर कारकों का विश्वसनीय माप प्रदान करता है; हालांकि, एस-चरण का माप सीमित था क्योंकि इरिडियम-आधारित डीएनए इंटरकैलेटर 2 एन और 4 एन डीएनए के बीच अंतर करने में असमर्थ था। सेल चक्र चरणों को परिभाषित करने के लिए, बेहबेहानी ने एक विधि विकसित की जो 127 के द्रव्यमान के साथ आईडीयू का उपयोग करती है, जो द्रव्यमान साइटोमीटर की सीमा के भीतर आती है और एस-चरण3 में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। यह प्रत्यक्ष माप द्वितीयक एंटीबॉडी या एसिड या डीएनएस जैसे डीएनए विकृत एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता को दरकिनार करता है। इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्करों के साथ संयोजन में, यह प्रयोगात्मक मॉडल में सेल चक्र वितरण के उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है।
यह प्रोटोकॉल एमसीएम के लिए सामान्य प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल से सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। हमारे तरीके सेल चक्र मापदंडों को शामिल करने के लिए एक सुविधाजनक और सरल तरीका प्रदान करते हैं। इन विट्रो नमूनों के आईडीयू निगमन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर केवल 10 से 15 मिनट की इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश बीआरडीयू स्टेनिंग प्रोटोकॉल की तुलना में कम है जो कई घंटों 3,7 के इनक्यूबेशन बार की सलाह देते हैं। आईडीयू और बीआरडीयू शामिल नमूने को प्रोटिओमिक स्टेबलाइजर का उपयोग करके तय किया जा सकता है और फिर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कुछ समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। यह नमूना गुणवत्ता में कमी के बिना बैच विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में आईडीयू दाग वाले नमूनों को संग्रहीत करने की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि सेल चक्र वितरण का विश्लेषण करने के लिए एमसीएम प्लेटफॉर्म का उपयोग कैसे करें। यह भी प्रदर्शित किया गया है कि सेल चक्र विश्लेषण प्रयोगात्मक स्थितियों जैसे सम…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने प्रयोगात्मक समर्थन के लिए पलक सेखरी, हुसाम अलखलाइलेह, सियाओची चांग और जस्टिन ल्यबर्गर के प्रयासों को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित था। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम को प्रतिबिंबित करें।
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
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