Anvendelse af pyrimidinanalogen, 5-Iodo-2′-deoxyuridin (IdU) med cellecyklusmarkører til at etablere cellecyklusfaser i en massecytometriplatform

Summary

Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger til brug i en massecytometriplatform. Med multiparameterfunktionerne i massecytometri muliggør direkte måling af jodinkorporering identifikation af celler i S-fase, mens intracellulære cykelmarkører muliggør karakterisering af hver cellecyklustilstand under en række eksperimentelle betingelser.

Abstract

Reguleringen af cellecyklusfase er et vigtigt aspekt af cellulær proliferation og homeostase. Forstyrrelse af de reguleringsmekanismer, der styrer cellecyklussen, er et træk ved en række sygdomme, herunder kræft. Undersøgelse af cellecyklussen kræver evnen til at definere antallet af celler i hver del af cellecyklusprogressionen samt klart at afgrænse mellem hver cellecyklusfase. Fremkomsten af massecytometri (MCM) giver et enormt potentiale for enkeltcelleanalyse med høj kapacitet gennem direkte målinger af elementære isotoper, og udviklingen af en metode til måling af cellecyklustilstanden ved MCM udvider yderligere nytten af MCM. Her beskriver vi en metode, der direkte måler 5-iodo-2′-deoxyuridin (IdU), svarende til 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU), i et MCM-system. Brug af denne IdU-baserede MCM giver flere fordele. For det første inkorporeres IdU hurtigt i DNA under dets syntese, hvilket muliggør pålidelig måling af celler i S-fasen med inkubationer så korte som 10-15 minutter. For det andet måles IdU uden behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrydning. For det tredje kan IdU-farvning let kombineres med måling af cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret histon H3 (pHH3), som samlet giver klar afgrænsning af de fem cellecyklusfaser. Kombination af disse cellecyklusmarkører med det høje antal parametre, der er mulige med MCM, tillader kombination med mange andre målinger.

Introduction

Massecytometri muliggør detektion af ca. 40 parametre ved at drage fordel af massespektroskopiens høje opløsning og kvantitative karakter. Metalmærkede antistoffer anvendes i stedet for fluoroforkonjugerede antistoffer, der giver mulighed for et højere antal kanaler og producerer minimal afsmitning ^1,2. MCM har fordele og ulemper med hensyn til cellecyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel ved MCM er, at det store antal parametre muliggør samtidig måling af cellecyklustilstand på tværs af et stort antal immunofænotypisk forskellige T-celletyper i meget heterogene prøver. MCM er med succes blevet anvendt til at måle cellecyklustilstanden under normal hæmatopoiesis i humant knoglemarv³ og transgene murinmodeller af telomerasemangel⁴. Analyse af cellecyklustilstand ved akut myeloid leukæmi (AML) viste, at cellecyklus korrelerede med kendte reaktioner på kliniske terapier, hvilket giver en in vivo-indsigt i funktionelle egenskaber, der kan informere behandlingsvalg⁵. En anden fordel ved massecytometrisk cellecyklusanalyse er evnen til at måle et stort antal andre funktionelle markører, der kan korreleres med cellecyklustilstand. Nyligt arbejde har været i stand til at korrelere protein- og RNA-syntese med cellecyklustilstand ved brug af IdU og metalmærkede antistoffer mod BRU og rRNA⁶. Denne form for meget parametrisk analyse, der måler cellecyklustilstand på tværs af adskillige populationer i et kontinuum af differentiering, ville være næsten umuligt med den nuværende flowcytometriteknologi. Den største ulempe ved MCM er manglen på DNA- eller RNA-pletter, der kan sammenlignes med dem, der anvendes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y osv.). Fluorescerende farvestoffer kan give relativt præcise målinger af DNA- og RNA-indhold, men denne præcision er kun mulig på grund af ændringerne i disse farvestoffers fluorescerende egenskaber, der opstår ved interkalering mellem nukleotidbaser. MCM-analyse er således ikke i stand til at måle DNA- eller RNA-indhold med tilsvarende præcision. I stedet er massecytometrisk cellecyklusanalyse afhængig af målinger af proteiner relateret til cellecyklustilstand, såsom cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret Histone H3 (pHH3) kombineret med direkte måling af jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetoder giver meget ens resultater under normal cellulær proliferation, men kan potentielt være uoverensstemmende, når cellecyklusprogression forstyrres.

Måling af antallet af celler i hver cellecyklusfase er vigtig for at forstå normal cellecyklusudvikling samt cellecyklusforstyrrelse, som almindeligvis observeres i kræft og immunologiske sygdomme. MCM giver pålidelig måling af ekstracellulære og intracellulære faktorer ved hjælp af metalmærkede antistoffer; Måling af S-fasen var imidlertid begrænset, da den iridiumbaserede DNA-interkalator ikke var i stand til at skelne mellem 2N- og 4N-DNA. For at definere cellecyklusfaser udviklede Behbehani en metode, der anvender IdU med en masse på 127, hvilket falder inden for massecytometerets område og tillader direkte måling af celler i S-fase³. Denne direkte måling omgår behovet for sekundære antistoffer eller brug af DNA-denatureringsmidler såsom syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære cykelmarkører tillader det høj opløsning af cellecyklusfordeling i eksperimentelle modeller.

Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger fra almindelige flowcytometriprotokoller til MCM. Vores metoder giver en bekvem og enkel måde at inkludere cellecyklusparametre på. Inkorporering af in vitro-prøver kræver kun 10 til 15 minutters inkubation ved 37 °C, hvilket er kortere end de fleste BrdU-farvningsprotokoller, der anbefaler inkubationstider på flere timer ^3,7. IdU- og BrdU-inkorporerede prøver kan fastgøres ved hjælp af en proteomisk stabilisator og derefter opbevares i nogen tid i en fryser på -80 °C. Dette gør det muligt at arkivere et stort antal IdU-farvede prøver til batchanalyse uden at reducere prøvekvaliteten.

Protocol

1. Forberedelse af IDU-lagre 5-iodo-2′-deoxyuridin (IdU) opløses i DMSO i en koncentration på 50 mM. Sterilt filter, alikvote i 10-50 μL reagensglas og opbevares ved -80 °C Fjern IdU fra fryseren, og tø op ved stuetemperatur. Fortynd IdU i RPMI-1640 for at lave en arbejdsløsning ved en slutkoncentration på 1 mM. Pipette op og ned eller hvirvel for at blande.Fortynd typisk den koncentrerede IdU i det medie, hvori cellerne dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM osv.), eller fortynd den til PBS til til…

Representative Results

Ved hjælp af HL-60-celler og et humant knoglemarvsaspirat er det muligt at vise, hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellecyklusfordeling og analyse. For det første skal gating-strategien etableres for at demonstrere, hvordan cellecyklusfaserne er afledt. I figur 1 viser vi etableringen af singletporten, som er vigtig for at adskille cellulært affald og dubletter, etablere en enkelt cellepopulation. For cellelinjer er singletporten alt, hvad der er nødvendigt for at gå videre t…

Discussion

De eksempler, der præsenteres her, viser, hvordan man bruger en MCM-platform til at analysere cellecyklusfordeling. Det er også blevet påvist, at cellecyklusanalyse er følsom over for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, hvilket er en vigtig overvejelse, som forskere skal tage, når de overvejer MCM til deres cellecyklusanalyse¹⁴. Prøver, der opbevares i en kort periode, ikke længere end en time, vil have IdU-inkorporering, der kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide