Bruk av pyrimidinanalog, 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) med cellesyklusmarkører for å etablere cellesyklusfaser i en massecytometriplattform

Summary

Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger for bruk i en massecytometriplattform. Med multiparameteregenskapene til massecytometri tillater direkte måling av jodinkorporering identifisering av celler i S-fase mens intracellulære syklusmarkører muliggjør karakterisering av hver cellesyklustilstand under en rekke eksperimentelle forhold.

Abstract

Reguleringen av cellesyklusfase er et viktig aspekt ved cellulær proliferasjon og homeostase. Forstyrrelse av reguleringsmekanismene som styrer cellesyklusen er en funksjon av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Studier av cellesyklusen nødvendiggjør evnen til å definere antall celler i hver del av cellesyklusprogresjonen, samt å tydelig avgrense mellom hver cellesyklusfase. Fremkomsten av massecytometri (MCM) gir et enormt potensial for enkeltcelleanalyse med høy gjennomstrømning gjennom direkte målinger av elementære isotoper, og utviklingen av en metode for å måle cellesyklustilstanden ved MCM utvider nytten av MCM ytterligere. Her beskriver vi en metode som direkte måler 5-jod-2′-deoksyuridin (IdU), tilsvarende 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU), i et MCM-system. Bruk av denne IdU-baserte MCM-en gir flere fordeler. For det første blir IdU raskt inkorporert i DNA under syntesen, noe som muliggjør pålitelig måling av celler i S-fasen med inkubasjoner så korte som 10-15 minutter. For det andre måles IdU uten behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrytning. For det tredje kan IdU-farging enkelt kombineres med måling av cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3), som samlet gir klar avgrensning av de fem cellesyklusfasene. Kombinasjon av disse cellesyklusmarkørene med det høye antallet parametere som er mulig med MCM, tillater kombinasjon med mange andre beregninger.

Introduction

Massecytometri gjør det mulig å detektere ca. 40 parametere ved å utnytte massespektroskopiens høyoppløselige og kvantitative natur. Metallmerkede antistoffer brukes i stedet for fluoroforkonjugerte antistoffer som tillater et høyere antall kanaler og gir minimal spillover ^1,2. MCM har fordeler og ulemper med hensyn til cellesyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel med MCM er at det store antallet parametere muliggjør samtidig måling av cellesyklustilstand over et stort antall immunfenotypisk distinkte T-celletyper i svært heterogene prøver. MCM har blitt brukt til å måle cellesyklustilstanden under normal hematopoiese i humant benmarg³ og transgene murine modeller av telomerasemangel⁴. Analyse av cellesyklustilstand ved akutt myelogen leukemi (AML) viste at cellesyklus korrelerte med kjente responser på kliniske terapier, noe som gir en in vivo innsikt i funksjonelle egenskaper som kan informere terapivalg⁵. En annen fordel med massecytometrisk cellesyklusanalyse er evnen til å måle et stort antall andre funksjonelle markører som kan være korrelert med cellesyklustilstand. Nylig arbeid har vært i stand til å korrelere protein- og RNA-syntese med cellesyklustilstand ved bruk av IdU og metallmerkede antistoffer mot BRU og rRNA⁶. Denne typen svært parametrisk analyse som måler cellesyklustilstand over mange populasjoner i et kontinuum av differensiering, ville være nesten umulig med dagens flowcytometriteknologi. Den største ulempen med MCM er mangelen på sammenlignbare DNA- eller RNA-flekker som de som brukes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Fluorescerende fargestoffer kan gi relativt nøyaktige målinger av DNA- og RNA-innhold, men denne presisjonen er bare mulig på grunn av endringene i fluorescerende egenskaper av disse fargestoffene som oppstår ved interkalering mellom nukleotidbaser. MCM-analyse er dermed ikke i stand til å måle DNA- eller RNA-innhold med tilsvarende presisjon. I stedet er massecytometrisk cellesyklusanalyse avhengig av målinger av proteiner relatert til cellesyklustilstand som cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3) kombinert med direkte måling av jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetodene gir svært like resultater under normal cellulær proliferasjon, men kan potensielt være uoverensstemmende når cellesyklusprogresjonen forstyrres.

Måling av antall celler i hver cellesyklusfase er viktig for å forstå normal cellesyklusutvikling samt cellesyklusforstyrrelser, som ofte observeres ved kreft og immunologiske sykdommer. MCM gir pålitelig måling av ekstracellulære og intracellulære faktorer ved bruk av metallmerkede antistoffer; Måling av S-fasen var imidlertid begrenset da den iridiumbaserte DNA-interkalatoren ikke klarte å skille mellom 2N og 4N DNA. For å definere cellesyklusfaser utviklet Behbehani en metode som benytter IdU med en masse på 127, som faller innenfor massecytometerets område og tillater direkte måling av celler i S-fase³. Denne direkte målingen omgår behovet for sekundære antistoffer eller bruk av DNA-denatureringsmidler som syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære syklusmarkører tillater det høy oppløsning av cellesyklusfordeling i eksperimentelle modeller.

Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger fra vanlige flowcytometriprotokoller for MCM. Våre metoder gir en praktisk og enkel måte å inkludere cellesyklusparametere på. IdU-inkorporering av in vitro-prøver krever bare 10 til 15 minutters inkubasjon ved 37 °C, noe som er kortere enn de fleste BrdU-fargeprotokoller som anbefaler inkubasjonstider på flere timer ^3,7. IdU- og BrdU-inkorporerte prøver kan festes ved hjelp av en proteomisk stabilisator og deretter lagres i en fryser på -80 °C. Dette gjør at et stort antall IdU-fargede prøver kan arkiveres for batchanalyse uten reduksjon i prøvekvalitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av IdU-aksjer Løs opp 5-jod-2′-deoksyuridin (IdU) i DMSO til en konsentrasjon på 50 mM. Sterilt filter, alikot i 10-50 μL rør, og oppbevares ved -80 °C Ta IdU ut av fryseren, og tine ved romtemperatur. Fortynn IdU i RPMI-1640 for å lage en arbeidsløsning ved en endelig konsentrasjon på 1 mM. Pipette opp og ned eller virvel å blande.Vanligvis fortynnes den konsentrerte IdU i mediet der cellene dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM, etc.) eller har fortynnet den til PBS for tilsetni…

Representative Results

Ved hjelp av HL-60-celler og et humant benmargsaspirat er det mulig å vise hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellesyklusfordeling og analyse. Først må gating-strategien etableres for å demonstrere hvordan cellesyklusfasene er avledet. I figur 1 viser vi etableringen av singletporten, som er viktig for å separere cellulært rusk og dubletter, og etablere en enkeltcellepopulasjon. For cellelinjer er singletporten alt som trengs for å gå videre til cellesyklusanalyse (<strong …

Discussion

Eksemplene som presenteres her viser hvordan man bruker en MCM-plattform til å analysere cellesyklusfordeling. Det har også blitt påvist at cellesyklusanalyse er følsom for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, noe som er en viktig vurdering forskere må ta når de vurderer MCM for deres cellesyklusanalyse¹⁴. Prøver som er lagret i en kort periode, ikke lenger enn en time, vil ha IdU-inkorporering som kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i et lukket system i lange per…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide