ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)
Summary
このプロトコルは、マスサイトメトリープラットフォームで使用するために細胞周期測定に適合させます。マスサイトメトリーのマルチパラメータ機能により、ヨウ素取り込みを直接測定することでS期の細胞を同定でき、細胞内サイクリングマーカーはさまざまな実験条件で各細胞周期状態の特性評価を可能にします。
Abstract
細胞周期相の調節は、細胞増殖および恒常性の重要な側面である。細胞周期を支配する調節機構の破壊は、癌を含む多くの疾患の特徴である。細胞周期の研究には、細胞周期の進行の各部分の細胞数を定義し、各細胞周期段階を明確に描写する能力が必要です。マスサイトメトリー(MCM)の出現は、元素同位体の直接測定によるハイスループットシングルセル分析の大きな可能性を提供し、MCMによる細胞周期状態の測定方法の開発は、MCMの有用性をさらに拡大します。ここでは、MCMシステムで5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)と同様に、5-ヨード-2′-デオキシウリジン(IdU)を直接測定する方法について説明します。この IdU ベースの MCM を使用すると、いくつかの利点があります。まず、IdUは合成中にDNAに急速に取り込まれるため、10〜15分の短いインキュベーションでS期の細胞を確実に測定できます。第二に、IdUは二次抗体やDNA分解を必要とせずに測定されます。第三に、IdU染色は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、およびリン酸化ヒストンH3(pHH3)の測定と簡単に組み合わせることができ、5つの細胞周期相の明確な描写をまとめて提供します。これらの細胞周期マーカーとMCMで可能な多数のパラメータとの組み合わせにより、他の多くの指標との組み合わせが可能になります。
Introduction
質量サイトメトリーは、質量分析法の高分解能と定量性を利用して、約40のパラメータの検出を可能にします。蛍光色素標識抗体の代わりに金属標識抗体が使用され、より多くのチャネルが可能で、スピルオーバーが最小限に抑えられます1,2。MCMには、フローサイトメトリーと比較して、細胞周期解析に関して長所と短所があります。MCMの主な利点の1つは、多数のパラメータにより、非常に不均一なサンプル中の多数の免疫表現型的に異なるT細胞タイプにわたる細胞周期状態を同時に測定できることです。MCMは、ヒト骨髄3およびテロメラーゼ欠損症4のトランスジェニックマウスモデルにおける正常造血中の細胞周期状態の測定に成功しています。急性骨髄性白血病(AML)における細胞周期状態の解析は、細胞周期が臨床療法に対する既知の反応と相関していることを示し、治療の選択に情報を提供できる機能的特徴へのin vivoの洞察を提供します5。マスサイトメトリー細胞周期分析の第2の利点は、細胞周期状態と相関し得る多数の他の機能マーカーを測定する能力である。最近の研究では、IdUとBRUおよびrRNA6に対する金属タグ付き抗体を使用することにより、タンパク質およびRNA合成を細胞周期状態と相関させることができました。分化の連続体における多数の集団にわたる細胞周期状態を測定するこの種の高度にパラメトリックな分析は、現在のフローサイトメトリー技術ではほぼ不可能です。MCMの主な欠点は、蛍光フローサイトメトリーで使用されるもの(DAPI、ヘキスト、ピロニンYなど)と同等のDNAまたはRNA染色がないことです。蛍光色素はDNAおよびRNA含量の比較的正確な測定を与えることができるが、この精度はヌクレオチド塩基間のインターカレーション時に生じるこれらの色素の蛍光特性の変化によってのみ可能である。したがって、MCM分析では、DNAまたはRNA含有量を同様の精度で測定することはできません。代わりに、マスサイトメトリー細胞周期分析は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、リン酸化ヒストンH3(pHH3)などの細胞周期状態に関連するタンパク質の測定と、S期細胞へのIdU取り込みからのヨウ素原子の直接測定に依存しています。これら2つの測定アプローチは、正常な細胞増殖中に非常に類似した結果をもたらしますが、細胞周期の進行が破壊されると、潜在的に不一致になる可能性があります。
各細胞周期期の細胞数の測定は、正常な細胞周期の発達や、がんや免疫疾患でよく見られる細胞周期の破壊を理解する上で重要です。MCMは、金属タグ付き抗体を使用して細胞外および細胞内因子の信頼性の高い測定を提供します。しかし、イリジウムベースのDNAインターカレーターは2Nと4NのDNAを区別できなかったため、S相の測定は制限されていました。細胞周期の段階を定義するために、Behbehaniは、質量サイトメーターの範囲内に収まり、S期3の細胞を直接測定できる質量127のIdUを利用する方法を開発しました。この直接測定により、二次抗体の必要性や、酸やDNaseなどのDNA変性剤の使用を回避できます。細胞内サイクリングマーカーと組み合わせることで、実験モデルにおける細胞周期分布の高分解能を可能にします。
このプロトコルは、MCMの一般的なフローサイトメトリープロトコルからの細胞周期測定を適応させます。私たちの方法は、細胞周期パラメータを含めるための便利で簡単な方法を提供します。in vitroサンプルのIdU取り込みは、37°Cで10〜15分のインキュベーションしか必要とせず、数時間のインキュベーション時間を推奨するほとんどのBrdU染色プロトコルよりも短い3,7。IdUおよびBrdUに組み込まれたサンプルは、プロテオミクス安定剤を使用して固定し、-80°Cの冷凍庫にしばらく保存できます。これにより、サンプルの品質を低下させることなく、バッチ分析のために多数のIdU染色サンプルをアーカイブすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する例は、MCM プラットフォームを使用して細胞周期分布を分析する方法を示しています。また、細胞周期解析は時間や温度などの実験条件に敏感であることが実証されており、これは研究者が細胞周期解析にMCMを検討する際に取らなければならない重要な考慮事項です14。1時間以内の短期間保管されたサンプルは、通常の状態に匹敵するIdUの取り込みになります…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Palak Sekhri、Hussam Alkhalaileh、Hsiaochi Chang、Justin Lyebergerの実験的支援の努力に感謝したい。この作業は、ペロトニアフェローシッププログラムによってサポートされました。この資料に記載されている意見、調査結果、結論は著者のものであり、必ずしもペロトニアフェローシッププログラムの意見、調査結果、結論を反映しているわけではありません。」
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
