الكشف عن تطور ورم الرئة في الفئران عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية
Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات المتخذة للحث على أورام الرئة في الفئران ، وكذلك القياس الكمي للأورام المشكّلة عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية. يتم تصور الأورام الصغيرة في النقاط الزمنية المبكرة كخطوط B. في وقت لاحق، يتم تحقيق قياسات حجم الورم النسبي من خلال أداة القياس في برنامج الموجات فوق الصوتية.
Abstract
مع حوالي 1.6 مليون ضحية سنويا، سرطان الرئة يساهم بشكل كبير في عبء السرطان في جميع أنحاء العالم. سرطان الرئة مدفوع جزئيا بالتغيرات الوراثية في الأورام مثل الأورام الأورام، الذي يشكل ~ 25٪ من حالات سرطان الرئة. الصعوبة في استهداف علاجيا سرطان الرئة التي تحركها KRAS تنبع جزئيا من وجود نماذج الفقراء التي يمكن أن تحاكي تطور المرض في المختبر. نحن نصف طريقة تسمح بالقياس الكمي النسبي لأورام الرئة الأولية KRAS في نموذج الماوس LSL-KRAS G12D من خلال التصوير بالموجات فوق الصوتية. تعتمد هذه الطريقة على السطوع (B) وضع اقتناء parenchyma الرئة. يتم تصور الأورام التي تتشكل في البداية في هذا النموذج كخطوط B ويمكن قياسها كمياً عن طريق حساب عدد خطوط B الموجودة في الصور المكتسبة. هذه تمثل عدد الورم النسبي الذي تم تشكيله على سطح رئة الماوس. مع تطور الأورام المشكّلة مع مرور الوقت، يُنظر إليها على أنها شقوق عميقة داخل الرئة. نظرًا لأن محيط الورم المتكون محدد جيدًا ، يتم حساب حجم الورم النسبي عن طريق قياس طول وعرض الورم وتطبيقه في الصيغة المستخدمة لقياسات فرجار الورم. التصوير بالموجات فوق الصوتية هو تقنية غير الغازية وسريعة وسهلة الاستعمال التي غالبا ما تستخدم لقياس الأورام في الفئران. على الرغم من أن القطع الأثرية قد تظهر عند الحصول على صور الموجات فوق الصوتية ، فقد ثبت أن تقنية التصوير هذه أكثر فائدة للتحديدالكمي للورم في الفئران مقارنة بتقنيات التصوير الأخرى مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير و التصوير الحيوي (BLI). يمكن للباحثين التحقيق في أهداف علاجية جديدة باستخدام هذه التقنية من خلال مقارنة بدء ورم الرئة والتقدم بين مجموعات مختلفة من الفئران.
Introduction
كسبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم ، لا يزال سرطان الرئة انكسارًا للعلاجات ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم وجود نماذج ما قبل السريرية ذات الصلة التي يمكن أن تُلخص المرض في المختبر1. حوالي 25٪ من حالات سرطان الرئة هي بسبب الطفرات في الأورام الأورام KRAS2. غالبًا ما يرتبط سرطان الرئة الذي يحركه KRAS بسوء التكهن وانخفاض الاستجابة للعلاج ، مما يسلط الضوء على أهمية إجراء مزيد من الدراسات في هذا المرض2.
لقد قمنا بتحسين طريقة تسمح بالتقييم النسبي لنمو ورم الرئة في الوقت الحقيقي في الفئران الكفؤة من المناعة الناجمة عن سرطان الرئة. نحن نستخدم Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) الفئران التي يمكن التعبير عن الأوكوجين KRAS G12D بواسطة ناقلات اللافيروسية Cre3،4. وتحرك هذه النواقل بواسطة الانهيرجس الكربوني 2، مما يسمح للعدوى الفيروسية أن تحدث على وجه التحديد في الخلايا الظهارية السنخية5. وبالإضافة إلى ذلك، لتسريع بدء وتطور أورام الرئة، ويبني lentiviral أيضا يعبر P53 شرنا من المروج U6/H1 (سيتم الإشارة إلى بناء lentiviral هنا باسم Ca2Cre-shp53)6. الأهمية البيولوجية لهذه الطريقة تكمن في المسار الطبيعي لتطور ورم الرئة في الفئران بدلا من xenografts من الأورام غير تقويم العظام في الفئران. عقبة باستخدام طريقة تقويم العظام هو رصد نمو ورم الرئة دون التضحية الماوس. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتحسين التصوير بالموجات فوق الصوتية للسماح بتحليل تطور ورم الرئة في وضع ثنائي الأبعاد (2D) في نموذج الماوس هذا. وتنعكس بدء الأورام في 7 أسابيع بعد العدوى كخطوط B في صور الموجات فوق الصوتية ، والتي يمكن عدها ، ولكنها لن تعكس العدد الدقيق للأورام الموجودة على الرئة. تتميز خطوط B بخطوط بيضاء عمودية تشبه الليزر الناشئة عن الخط الجنبي في الرئة parenchyma7،8. يمكن تصور الأورام الكبيرة بعد 18 أسبوعًا من العدوى. يتم قياس الحجم النسبي لهذه الأورام من خلال القياسات 2D القيام به على الموجات فوق الصوتية.
هذه الطريقة هي الأمثل للباحثين التحقيق في تأثير الأدوية الدوائية على نمو ورم الرئة في نموذج الماوس LSL-KRAS G12D. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مقارنة تطور ورم الرئة بين الفئران ذات الأنساب الوراثية المختلفة ، لدراسة أهمية وجود أو عدم وجود جينات / بروتينات معينة على تطور حجم ورم الرئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نبين طريقة يمكن أن تقيّم نمو ورم الرئة في نموذج الماوس LSL-KRAS G12D القابل للاختزال عن طريق الموجات فوق الصوتية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم تأثير مثبطات الأدوية على نمو ورم الرئة. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقارنة نمو ورم الرئة بين الفئران من خلفيات وراثية مختلفة. استخدام هذه التقنية لا يتط…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور I. فيرما لناقلات Ca2Cre-shp53 اللافيروسية. تم دعم العمل من خلال أموال من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR MOP 137113) إلى AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
