在沙门氏菌感染组织培养细胞中，NF-βB依赖性路西酶的激活和基因表达的定量
Summary
在这里，我们提出了一个协议，通过测量细胞裂解中的发光，快速、轻松地测量活性B细胞（NF-B）激活细胞系中激活的核因子kappa-光链增强剂：：快星酶报告器结构。此外，基因表达通过从感染沙门氏菌的细胞中分离的RT-qPCR确定。
Abstract
二分体转录因子NF-βB调节许多细胞反应途径，包括通过诱导各种细胞因子和化学因子的表达来引起炎症通路。NF-βB是组织表达的，通过B细胞抑制剂α（I+B+）中的卡帕光多肽基因增强剂的抑制蛋白核因子在细胞溶质中固存。NF-βB的激活需要I+B+的降解，然后它暴露NF-βB上的核定位信号，并促进其向核的贩运。一旦进入细胞核，NF-βB与NF-βB靶基因的介子基因（如白细胞介素6（IL-6）和IL-23）的介动区域结合，以促进其表达。
NF-βB 的激活独立于转录或翻译而发生。因此，NF-βB的激活状态必须通过在核中具体量化NF-βB，或者通过量化NF-βB靶基因的表达来测量。在此协议中，使用NF-βB：：乳酸酶报告器构造的细胞通过体外组织培养技术进行NF-βB激活。这些细胞感染了沙门氏菌，以激活NF-βB，它流到细胞核，并结合在荧光素酶的启动区βB位点，诱导其表达。细胞用荧光素酶测定系统进行分化和分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号的强度相关，发光信号由板读取器检测到。此过程生成的发光信号提供了一种快速且高度敏感的方法，用于评估 NF-+B 在一系列条件下的激活。该协议还利用定量逆转录PCR（RT-qPCR）来检测指示基因表达的相对mRNA水平。
Introduction
核因子-βB（NF-B）系列蛋白质是调节各种生物途径中基因表达的重要转录活化剂。NF-βB的激活诱导靶基因的转录，其中许多基因对免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应和癌症进展1、2都很重要。NF-βB在调解早期炎症结果以清除病原体方面起着不可或缺的作用。鉴于由NF-β-B激活调节的许多生物过程，其信号中断可能会对健康和疾病产生严重后果。NF-βB信号的功能突变的丧失与几种免疫缺陷表型有关，而功能突变的增益与几种癌症有关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌3。此外，许多病原体已被证明通过表达毒性因子4、5、6、7直接调节NF-βB的激活状态。
NF-βB的激活被认为是许多可变刺激的结果，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭霉蛋白和称为病原体相关分子模式（PAMPs）的肽类。这些PAMP由模式识别受体（PRRs）检测，如收费受体（TPR）和点头样受体（NLRs），导致NF-βB的激活和NF-βB依赖性炎症基因8的后续表达。除了PPP的PRR活化外，其他细菌产物，如细菌效应蛋白，可以诱导NF-βB的活化。有趣的是，细菌还表达有效蛋白，主动衰减NF-βB通路，增强其致病性，强调NF-βB作为免疫9的重要中介的重要性。
有五个不同的子单位，形成NF-βB二聚体;p50，p52，RelA（p65），RelB 和 crel。两个主要的NF-+B杂物是p50：RelA和p52：RelB二聚苯醚。激活的NF-βB二聚体结合各种目标基因的启动子和增强剂区域的DNA位点，称为βB位点。在正常的静息条件下，NF-βB与一系列称为I+B蛋白的抑制剂蛋白相互作用，保持不活性。在刺激时，I+B由I+B基纳斯（IKK）磷酸化，允许其被靶向成泛化，并随后降解。I+B 的降解通过揭示核定位信号激活 NF-+B。NF-βB然后转移到细胞核，在目标基因的启动位区域结合βB位点，促进转录10。因此，NF-βB的激活调节了NF-βB靶基因的mRNA表达，这种变化可以通过RNA定量测定，如RT-qPCR11。
存在几种方法，通常用于NF-βB活化的测量，包括电泳移动转移测定（EMSA）、核易位和基因报告器测定。EMSA用于检测核酸的蛋白质复合物。刺激细胞被分馏以分离核蛋白，包括转移的NF-βB，然后用含有NF-βB结合域的放射性标记核苷酸孵育。样品在凝胶上运行，并通过32个P标记核酸的自成像成像。如果NF-βB存在于蛋白质馏分中，它将结合核苷酸，核苷酸在凝胶中迁移较慢，并作为离散带出现。缺乏活性NF-βB（例如，未刺激控制细胞）的细胞的核部分不会产生带状，因为核苷酸会更快地迁移到凝胶的末端。此方法的一个主要缺点是，它在很大程度上是定量的二进制意义上的（即打开或关闭），并且不能充分捕获 NF-+B 绑定容量中有意义的差异。此外，这种方法不考虑对NF-βB靶基因12、13具有功能重要性的染色质结构。
与前一种方法类似，存在一种”非移位”测定法，其中多孔板涂有含有NF-βB结合序列的核苷酸。在对含有核蛋白质成分的细胞进行处理后，NF-βB将与结合在井上的核苷酸结合。然后加入抗NF-βB抗体，与结合的NF-βB相互作用，产生与NF-βB量成比例的色度信号，指示NF-βB的激活程度。这种方法优于EMSA，因为它不需要放射性标记的核酸，是定量的，相比之下。然而，这种方法的一个警告是，它再次不区分NF-βB靶基因14的染色质状态。
另一种可以检测NF-βB活化的方法是通过染色质免疫沉淀（ChIP），即DNA和相互作用的蛋白质与甲醛交联，免疫沉淀与特定的抗NF-β-B抗体。然后，通过PCR扩增或直接高通量测序，对特定的核苷酸片段进行纯化和识别。该方法产生的结果是NF-βB结合活性与靶基因的半定量结果。然而，结果高度依赖于每个步骤15的固定条件和纯化过程。
在核易位测定中，细胞被刺激诱导NF-βB激活，然后固定。抗p65抗体被添加到固定细胞。或者，p65 亚单位本身可以使用荧光肽（如绿色荧光绿色 （GFP））标记。在这两种情况下，免疫荧光将允许对p65的定位进行成像，以确定细胞分布。通过测量细胞和核局部蛋白的比例，研究者可以确定NF-βB的相对激活状态。这种方法的缺点是免疫荧光相对耗时，需要昂贵的抗体，并且需要相对更高的技术专长16。
报告基因是研究感兴趣的基因的调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因是由一个感兴趣的基因的启动子序列构建的，该基因与一种易于检测的蛋白质的基因编码有关。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白质通常被选择用于测定和量化。因此，读出（例如，发光、荧光）作为检测基因表达的信号。然后，这些报告器构造可以引入到不同的细胞类型中，如上皮细胞或巨噬细胞。
该协议中描述的是使用克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A），该细胞系通过含有免疫球蛋白β链促进器区域17的三个βB共识的荧光酶报告器进行稳稳的转染。荧光素酶的表达取决于NF-βB的激活，在细胞刺激后发生。使用荧光素酶测定试剂盒中提供的细胞乳液酶缓冲液，可轻松对刺激细胞进行分莱。然后，细胞莱沙的一部分与含有荧光素的荧光素酶测定缓冲液混合。路西法林是荧光素酶的基质，在荧光素酶存在的情况下生成光是必需的。将测定缓冲液与解液结合后，溶液将在称为发光的工艺中发出光。以流明表示的发光量与流沙中存在的荧光素酶量成正比，并用作 NF-βB 活化的量度。与未刺激的标准相比，对流明读数进行解释，以考虑基线 NF-+B 活性，信号本身稳定几分钟，以便进行可靠的测量。此外，HeLa 57A 细胞系通过 NF-βB 独立 β-乳糖酶报告器进行稳稳的转染。β-乳糖酶报告器是构成性的表达，β-乳糖酶活性可以测量，以控制细胞的存活性或细胞数17的变化。然后，可调整荧光酶值，以调整到β-乳糖酶值，并报告为在未刺激的控制细胞上增加的褶皱。
由于NF-βB是负责NF-βB依赖性靶基因表达增加的转录因子，因此控制NF-βB依赖性增加基因表达的后续实验是定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，通过这种方法，基因表达的变化可以量化在几个数量级。通过苯酚氯仿提取为RNA采集刺激和控制细胞。相分离后，RNA作为水层的主要成分被提取。然后，RNA被沉淀和洗涤，产生纯颗粒。然后，通过DNase处理，再重组并进一步清除污染物DNA。然后反向转录纯RNA，以创建互补DNA（cDNA）。然后，可以通过定量PCR技术分析该cDNA，其中对特定mRNA序列的丰度进行量化以确定基因表达。此技术不能阐明翻译控制、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性。然而，许多基因，尤其是那些参与亲炎过程的基因，通过NF-βB进行调控，其mRNA丰度表示其表达。
这里提出的方法采用一种快速、简单的方法，通过细胞莱沙的发光检测可以检测NF-βB的活化。NF-βB靶基因表达的RT-qPCR可用于量化特定基因的表达，以及验证NF-βB活化的功能活性。这种系统的主要优点是其简单性和速度，允许对调节 NF-+B 激活的一系列条件进行高吞吐量筛选。该协议适用于表达NF-βB：：乳酸酶报告器的其他细胞系，并已在稳稳转染RAW264.7细胞18中得到证明。处理样品所需的时间（从细胞溶解到产生发光信号）非常少，大约需要一个小时。NF-+B 的测量只需要基本的实验室设备，如不透明板、能够测量发光的板式读取器以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。
Protocol
Representative Results
Discussion
所述协议的主要贡献是，它提供了一种快速和简单的方法来检测细胞中的NF-βB激活，从而能够对影响NF-βB活化的多种刺激条件或药物进行高通量分析。在这里，我们描述了在沙门氏菌感染的HeLa细胞中NF-βB激活的协议。这些细胞可用于感染其他病原体，以及研究细菌感染对NF-βB活化的影响。此外，在HeLa 57A细胞中NF-βB依赖性荧光酶活化可用于筛选信号通路的活化剂或抑制剂，导致NF-βB激活。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keestra-Gounder 实验室的研究由 NIH NIAID 提供编号为 R21AI122092 的资助，美国糖尿病协会获得第 1-18-JDF-035 奖的资助。
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
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