살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화
Summary
여기서, 우리는 NF-θB를 발현하는 세포주에서 활성화된 B 세포(NF-θB)의 핵 인자 카파-라이트 체인 인핸서를 빠르고 쉽게 측정하는 프로토콜을 제시한다:루시퍼라아제 리포터 구성, 세포 용해물 내 발광의 측정을 통해. 추가적으로, 유전자 발현은 살모넬라 티피무리움에 감염된 세포로부터 분리된 RT-qPCR을 통해 결정된다.
Abstract
dimeric 전사 인자 NF-θB는 다양한 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도함으로써 염증 경로를 포함한 많은 세포 반응 경로를 조절한다. NF-θB는 B 세포 억제제, 알파(IθBα)에서 카파광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 억제 단백질 핵 인자에 의해 세포졸에서 세포적으로 발현되고 격리된다. NF-θB의 활성화는 IθBα의 분해를 요구하며, 이는 NF-θB에 핵 국소화 신호를 노출시키고 핵으로의 인신매매를 촉진한다. 일단 핵에서, NF-θB는 그들의 발현을 촉진하기 위해 인터류키핀 6(IL-6) 및 IL-23과 같은 NF-θB 표적 유전자의 운동 영역에 결합한다.
NF-θB의 활성화는 전사 또는 번역과 독립적으로 발생합니다. 따라서, NF-θB의 활성화 상태는 핵에서 특별히 NF-θθ를 정량화하거나, NF-θB 표적 유전자의 발현을 정량화함으로써 측정되어야 한다. 이 프로토콜에서, NF-θB로 안정적으로 형질감염된 세포는 시험관내 조직 배양 기술을 사용하여 NF-θB 활성화를 위해 분석된다. 이 세포는 NF-θB를 활성화하기 위하여 살모넬라 티피무륨에 감염되고, 이는 핵으로 트래픽및 루시퍼라아제라아제의 프로모터 지구에 있는 θB 사이트에 결합하여, 그것의 발현을 유도합니다. 세포는 루시퍼라아제 분석 시스템으로 분석하고 분석한다. 세포에 의해 생성된 루시퍼라아제의 양은 플레이트 리더에 의해 검출되는 발광 신호의 강도와 상관관계가 있습니다. 이 절차에 의해 생성된 발광 신호는 다양한 조건 하에서 NF-θB 활성화를 평가하는 빠르고 매우 민감한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 발현을 나타내는 상대적인 mRNA 수준을 검출하기 위해 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)을 이용한다.
Introduction
단백질의 핵 인자-θB (NF-θB) 가족은 다양한 생물학적 경로에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 전사 활성제이다. NF-θB의 활성화는 표적 유전자의 전사를 유도하며, 그 중 많은 것이 면역 및 염증 반응, 세포 증식, 스트레스 반응 및 암진행에중요하다1,2. NF-θB는 병원체 클리어런스를 위한 초기 염증 결과를 중재하는 데 필수적인 역할을 합니다. NF-θB 활성화에 의해 매개되는 많은 생물학적 과정을 감안할 때, 신호의 중단은 건강과 질병에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. NF-θB 신호에 있는 기능 돌연변이의 손실은 몇몇 면역 결핍 표현형에서 연관되는 반면, 기능 돌연변이의 이득은 B 세포 림프종 및 유방암을 포함하여 암의 몇몇 모형과 연관됩니다3. 부가적으로, 많은 병원체는독성 인자4,5,6,7의발현을 통해 NF-θ의 활성화 상태를 직접 조절하는 것으로 나타났다.
NF-θB의 활성화는 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)으로 알려진 리포폴리사카라이드(LPS), 플래그엘린 및 펩티도글리칸과 같은 세균성 제품을 포함한 많은 가변 자극의 결과인 것으로 알려져 있다. 이러한 PAMPs는 NF-θB의 활성화및 NF-θB 의존성 염증 유전자의 어레이의 후속 발현을 유도하는 톨-유사 수용체(TL) 및 Nod-like 수용체(LRS)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 검출된다8. PAMPs에 의한 PRR 활성화 이외에, 세균 효과 단백질과 같은 다른 세균성 제품은, NF-θB의 활성화를 유도할 수 있다. 흥미롭게도, 박테리아는 또한 NF-θ 통로를 능동적으로 감쇠시키고 그들의 병원성을 향상시키는 이펙터 단백질을 발현하며, 면역의 필수적인 중재자로서 NF-θB의 중요성을강조한다 9.
NF-θB 이dim을 형성하는 5개의 다른 하위 단위가 있습니다; p50, p52, RelA (p65), RelB 및 cRel. 두 가지 주요 NF-θB 헤테로디머는 p50:RelA 및 p52:RelB 이형제입니다. 활성화된 NF-θB 디이머는 다양한 표적 유전자의 프로모터 및 인핸서 영역에서 σB 부위로 알려진 DNA 부위에 결합한다. 정상적인 동압 조건하에서, NF-θB는 IθB 단백질로 알려진 억제제 단백질의 가족과 상호 작용하여 비활성 상태를 유지합니다. 자극시, IθB는 IθB 키나아제(IKK)에 의해 인산화되어 유비퀴틴화를 표적으로 하고, 이어서 분해할 수 있게 한다. IθB의 분해는 핵 국소화 신호를 밝혀 NF-θB를 활성화한다. NF-θB는 그 후 핵으로 옮겨, 여기서 표적 유전자의 프로모터 영역에서 σB 부위를 결합시키고 전사10을촉진한다. 따라서, NF-θB의 활성화는 NF-θB 표적 유전자의 mRNA 발현을 상향 조절하며, 이러한 변화는 RT-qPCR11과같은 RNA 정량화 분석제를 통해 측정될 수 있다.
몇몇 방법은 존재하고 일반적으로 전기 영동 이동성 이동 분석법 (EMSA), 핵 전좌 및 유전자 리포터 분석법을 포함하여 NF-θB 활성화의 측정을 위해 이용됩니다. EMSA는 핵산이 있는 단백질 복합체를 검출하는 데 사용됩니다. 자극된 세포는 전좌된 NF-θ를 포함하는 핵 단백질을 분리하기 위해 분획되고, 이어서 NF-θB 결합 도메인을 포함하는 방사성 표지된 뉴클레오티드로 배양된다. 견본은 젤에 실행되고 32P 표지한 핵산의 자기 방사선 촬영에 의해 심상됩니다. NF-θB가 단백질 분획에 존재하는 경우, 뉴클레오티드를 결합시킬 것이며, 이는 겔을 통해 느리게 이동하고 이산 밴드로서 존재할 것이다. 활성 NF-θB(예를 들어, 비자극된 대조군 세포)가 결여된 세포의 핵 분획은 뉴클레오티드가 겔의 끝으로 더 빨리 이동함에 따라 아무밴드도 생성되지 않을 것이다. 이 방법의 주요 단점은 이진 의미에서 크게 정량적이며 NF-θB 결합 용량에서 의미 있는 차이를 적절히 포착하지 못한다는 것입니다. 부가적으로, 이 방법은 NF-θB 표적 유전자12,13에대해 기능적으로 중요한 염색질 구조를 고려하지 않는다.
이전 방법과 유사하게, 다중 웰 플레이트가 NF-θB 결합 서열을 함유하는 뉴클레오티드로 코팅되는 “비시프트” 분석법이 있다. 단백질의 핵 분획으로 세포의 처리 후, NF-θB는 웰에 결합된 뉴클레오티드에 결합할 것이다. 항-NF-θB 항체가 추가되고, 이는 결합된 NF-θB와 상호 작용하고 NF-θB의 양에 비례하는 색색 신호를 생성하며, 이는 NF-θB 활성화의 정도를 나타낸다. 이 방법은 방사성 표지된 핵산을 필요로 하지 않으며 정량적이라는 점에서 EMSA에 비해 유리하다. 그러나, 이 방법의 주의사항은 NF-θB 표적 유전자14의염색질 상태를 다시 분화하지 않는다는 것이다.
NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 또 다른 방법은 크로마틴 면역침전(ChIP)에 의해, DNA 및 상호 작용 단백질이 포름알데히드와 가교되고 특정 항-NF-θB 항체와 면역침전된다. 특정 뉴클레오티드 단편은 PCR 증폭 또는 직접 높은 처리량 시퀀싱을 통해 정제되고 식별됩니다. 이 방법으로부터 생성된 결과는 표적 유전자와 NF-θB 결합 활성의 반정량적 결과를 제공한다. 그러나, 결과는 각단계(15)에서고정 조건 및 정제 공정에 크게 의존한다.
핵 전좌 검역 실험에서, 세포는 NF-θB 활성화를 유도하기 위하여 자극되고 그 후 고정됩니다. 항-p65 항체는 고정 된 세포에 추가됩니다. 대안적으로, p65 소단위 자체는 녹색 형광녹색(GFP)과 같은 형광 펩티드로 태그될 수 있다. 두 경우 모두, 면역형광은 p65의 국소화영상을 허용하여 세포 분포를 결정할 것이다. 세포질 및 핵 국소화 단백질의 비율을 측정함으로써, 조사자들은 NF-θB의 상대적 활성화 상태를 결정할 수 있다. 이 방법의 단점은 면역형광이 비교적 시간이 많이 걸리고, 고가의 항체가 필요하며, 상대적으로 더 큰 기술적 전문지식이 필요하다는 것이다16.
리포터 유전자는 관심 있는 유전자의 조절 및 발현 패턴을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 도구입니다. 전형적으로, 리포터 유전자는 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된 관심 있는 유전자의 프로모터 서열로부터 구성된다. 효소 활동, 형광 또는 발광 특성을 가진 단백질은 일반적으로 분석 및 정량화될 수 있는 그들의 능력을 위해 선택됩니다. 따라서, 판독(예를 들어, 발광, 형광)은 유전자 발현의 검출을 위한 신호로서 역할을 한다. 이러한 리포터 구조는 상피 세포 또는 대식세포와 같은 상체 세포 유형으로 도입될 수 있다.
본 프로토콜에 기재된 클론된 HeLa 세포주(HeLa 57A)는 면역글로불린 σ-chain 프로모터영역(17)의3개의 θB 컨센서스의 3개의 사본을 포함하는 루시퍼라제 리포터로 안정적으로 형질이 나는 것을 사용한다. 루시퍼라아제의 발현은 세포 자극 다음에 발생하는 NF-θB의 활성화에 의존한다. 자극된 세포는 루시퍼라아제 분석 키트에 제공된 세포 용해 완충제를 사용하여 용이하게 용해된다. 세포 포액의 부분은 루시페린을 포함하는 루시페라아제 분석 버퍼와 혼합됩니다. 루시펠린은 루시퍼라아제의 기질이며 루시퍼라아제의 존재 시 빛의 생성에 필요합니다. 분석 버퍼와 용해액을 결합한 후, 용액은 발광으로 알려진 공정에서 빛을 방출합니다. 루멘으로 생성되는 빛의 양은 용해액에 존재하는 루시퍼라아제의 양에 비례하며 NF-θB 활성화의 척도로서 작용한다. 루멘 판독값은 기준선 NF-θB 활성을 고려하기 위해 비자극표준과 비교하여 해석되며, 신호 자체는 신뢰할 수 있는 측정을 위해 몇 분 동안 안정되어 있다. 또한, HeLa 57A 세포주들은 NF-ΘB-독립적인 β-갈락토시다아제 리포터로 안정적으로 형질감염된다. β-갈락토시다아제 리포터는 구성적으로 발현되고, β-갈락토시다아제 활성은 세포 생존성 또는 세포 수의 변이를 조절하기 위해 측정될 수 있다17. 루시퍼라제 값은 β-갈락토시다아제 값으로 조정될 수 있고 자극되지 않은 대조군 세포에 비해 배 증가가 보고될 수 있다.
NF-θB는 NF-θB-의존성 표적 유전자의 증가된 발현을 담당하는 전사 인자이기 때문에, NF-θB-의존성 증가유전자 발현을 조절하기 위한 후속 실험은 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응( RT-qPCR)을 참조하십시오. RT-qPCR은 유전자 발현의 변화가 여러 계급의 크기에 걸쳐 정량화될 수 있는 매우 민감한 방법이다. 자극 및 제어 세포는 페놀 클로로포름 추출을 통해 RNA를 위해 수확됩니다. 상 분리 후, RNA는 수성 층의 주요 성분으로서 추출된다. RNA는 순수한 펠릿을 생성하기 위해 침전되고 세척됩니다. 이 펠릿은 DNase 치료를 통해 오염 DNA를 재구성하고 추가로 청소합니다. 순수한 RNA는 그 때 상보적인 DNA (cDNA)를 만들기 위하여 역으로 전사됩니다. 이 cDNA는 그 때 특정 mRNA 순서의 풍부가 유전자 발현을 결정하기 위하여 정량화되는 양적 PCR 기술을 통해 분석될 수 있습니다. 이 기술은 번역 제어, 사후 번역 수정, 단백질 풍부 또는 단백질 활성을 설명하지 않습니다. 그러나, 많은 유전자, 특히 프로 염증 과정에 관여하는 유전자는 NF-θB를 통해 조절되고 그들의 mRNA 풍부는 그들의 발현을 나타냅니다.
여기서 제안된 방법은 세포 용해물의 발광 검술을 통해 NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 빠르고 간단한 방법을 이용한다. NF-θB 표적 유전자 발현의 RT-qPCR은 특정 유전자의 발현을 정량화하고, NF-θB 활성화의 기능적 활성을 검증하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 주요 장점은 NF-θB 활성화를 조절하는 다양한 조건의 높은 처리량 스크리닝을 허용하는 단순성과 속도입니다. 이 프로토콜은 NF-θB::luciferase 리포터를 발현하는 다른 세포주에 적합하며, 안정적으로 형질감염된 RAW264.7세포(18)에서입증되었다. 세포 용해에서 발광 신호 생성에 이르기까지 샘플을 처리하는 데 필요한 시간은 최소화되고 약 1 시간의 기간이 소요됩니다. NF-θB의 측정에는 불투명 플레이트, 발광을 측정할 수 있는 플레이트 리더, 스프레드시트 프로그램과 같은 간단한 데이터 분석 소프트웨어와 같은 기본적인 실험실 장비만 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 프로토콜의 주요 기여는 세포에서 NF-θB 활성화를 검출하는 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 이는 NF-θB 활성화에 영향을 미치는 다중 자극 조건 또는 약물의 높은 처리량 분석을 허용한다는 것입니다. 여기서, 우리는 살모넬라-감염된HeLa 세포에서 NF-θB 활성화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 세포는 NF-θB 활성화에 세균성 감염의 충격을 공부하기 위하여 뿐만 아니라 그밖 병원체를 가…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keestra-Gounder 실험실에 있는 연구는 수상 번호 R21AI122092의 밑에 NIH의 NIAID및 상 번호 1-18-JDF-035의 밑에 미국 당뇨병 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
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