Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller
Summary
Här presenteras ett protokoll för generering av en encellig kultur av mänskliga embryonala stamceller och deras efterföljande differentiering till neurala stamcells celler. Protokollet är enkelt, robust, skalbar och lämplig för läkemedels screening och regenerativ medicin applikationer.
Abstract
In vitro differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har förändrat förmågan att studera mänsklig utveckling på både biologiska och molekylära nivåer och som celler för användning i regenerativa tillämpningar. Standard metoder för hESC kultur med hjälp av kolonin typ kultur för att bibehålla odifferentierade hESCs och embryoid kropp (EB) och rosett formation för differentiering i olika köns lagren är ineffektiva och tidskrävande. Här presenteras en encellig kultur metod med hjälp av hESCs istället för en koloni-typ kultur. Denna metod möjliggör underhåll av de karakteristiska dragen i odifferentierade hESCs, inklusive uttryck av hESC markörer på nivåer jämförbara med kolonin typ hESCs. Dessutom, protokollet presenterar en effektiv metod för neurala progenitorceller (NPC) generation från Single-celltyp hESCs som producerar NPC inom 1 vecka. Dessa celler uttrycker högt flera NPC markörgener och kan differentiera till olika neurala celltyper, inklusive dopaminerga neuroner och astrocyter. Detta encellig kultur system för hESCs kommer att vara användbart för att undersöka de molekylära mekanismerna i dessa processer, studier av vissa sjukdomar, och Drug discovery skärmar.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har potential att differentiera till de tre primära bakterie lagren, som sedan differentieras till olika multipotenta stamcellslinjer. Dessa härstamningar ger därefter upphov till alla celltyper i människokroppen. In vitro har hESC kultur system förändrat förmågan att studera mänsklig embryonal utveckling och har fungerat som ett värdefullt verktyg för att få nya insikter i hur dessa processer regleras på biologisk och molekylär nivå. På samma sätt ger studier av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som genereras från omprogrammering av somatiska celler isolerade från mänskliga patienter nya insikter i olika sjukdomar. Dessutom kan stamceller och differentierade celler som härrör från hESCs vara användbara för forskning som involverar stamcellsterapi och läkemedels screening1,2,3,4.
hESCs kan induceras för att differentiera till neurala progenitorceller (NPCs), som är multipotentialceller med en omfattande självförnyelse kapacitet. Därefter kan dessa celler differentieras till nervceller, astrocyter, och oligodendrocyter5,6. NPCs erbjuder också ett cellsystem för in vitro-studier av neuroutvecklingsbiologi och olika neurologiska sjukdomar. Men nuvarande koloni typ kultur metoder som involverar hESCs och deras differentiering i NPC är ineffektiva och ofta involverar samodling samt embryoid kropp (EB) och rosett formation5,7,8,9. Dessa protokoll uppvisar lägre överlevnadsgrad och spontan differentiering och är mer tidskrävande.
Presenteras här är ett förbättrat och robust kultur system som är lätt skalbar och använder hög densitet Single-celltyp kultur av hESCs10. Införandet av Roh-Kinas (Rock) hämmare bidragit till signifikant ökad överlevnad effektivitet under Single celltyp kultur av hESC10,11,12,13,14. I detta kultur system kan hESCs lätt underhållas och utökas. Dessutom utgör protokollet en effektiv metod för att skapa NPC-er från encellig typ kultur av hESCs, som gör det möjligt att tillverka mycket rena NPC: er. hämning av BMP/tgfβ/Activin signalering vägar med ALK-hämmare inducera effektivt differentiering av encellig typ hESCs i NPCs15,16, som sedan kan induceras för att differentiera till funktionella neurala linjer, såsom dopaminerga neuroner och astrocyter.
Sammanfattnings, den Single-celltyp kultur protokoll med hjälp av hESCs erbjuder en attraktiv modell för att studera differentiering av dessa celler i olika linjer, inklusive NPCs. Detta protokoll är lätt att skalbart och lämpar sig därför för att generera celler för forskning som involverar regenerativ terapi och läkemedels screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skalbara och effektiva metoder för differentiering av hESCs i olika linjer och generering av tillräckligt antal differentierade celler är viktiga kriterier för läkemedels screening och stamcellsterapi. Olika Single-cell passerar metoder har publicerats, där celler odlas i närvaro av sten-hämmare eller andra små molekyler för att förbättra överlevnaden, men de slutliga produkterna av dessa kultur metoder är kolonin typ hESCs17,18,<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) för hans hjälp med FACS-analysen. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 till AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologie du développement. 313 (1), 107-117 (2008).
