Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide
Summary
Nous présentons un système robuste, transférable et prédictif d’exposition in vitro pour le criblage et la surveillance des particules aéroportées concernant leur cytotoxicité pulmonaire aigue en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide (ALI).
Abstract
Ici, nous présentons un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition homogène des cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (par exemple, la fumée de cigarette), fournissant ainsi des aspects physiologiques réalistes l’exposition de la surface apaïque de la région alvéolienne humaine à l’air. Contrairement aux modèles d’exposition séquentielle avec guidage linéaire d’aérosol, la conception modulaire du système d’écoulement radial répond à toutes les exigences pour la génération et le transport continus de l’atmosphère d’essai aux cellules, une distribution homogène et le dépôt de particules et l’élimination continue de l’atmosphère. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition des cellules aux particules en suspension dans l’air, mais peut être adaptée à l’exposition d’aérosols liquides et de gaz hautement toxiques et agressifs selon la méthode de production d’aérosols et le matériau des modules d’exposition. .
Dans le cadre d’une étude de validation récemment terminée, ce système d’exposition a été prouvé comme une méthode de dépistage transférable, reproductible et prédictive pour l’évaluation qualitative de la cytotoxicité pulmonaire aigue des particules en suspension dans l’air, potentiellement réduire ou remplacer les expériences animales qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.
Introduction
L’inhalation de particules toxiques en suspension dans l’air est un problème de santé publique, entraînant une multitude de risques pour la santé dans le monde entier et plusieurs millions de décès par an1,2. Le changement climatique, le développement industriel en cours et la demande croissante d’énergie, d’agriculture et de produits de consommation ont contribué à l’augmentation des maladies pulmonaires au cours des dernières années3,4,5,6. La connaissance et l’évaluation des substances inhalables concernant leur toxicité par inhalation grave constituent la base de l’évaluation des risques et de la gestion des risques, mais cette information fait encore défaut pour un large éventail de ces substances7,8. Depuis 2006, la législation de l’UE sur les produits chimiques REACH (Enregistrement, Évaluation, Autorisation et Restriction des produits chimiques) exige que les produits déjà existants et nouvellement introduits subissent une caractérisation toxicologique, y compris la voie d’inhalation, avant d’être mis sur le marché. Par conséquent, REACH met l’accent sur les méthodes alternatives et sans animaux, la mise en œuvre du principe « 3R » (Remplacement, raffinement et réduction des expériences animales) et l’utilisation de modèles in vitro appropriés9. Au cours des dernières années, de nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale différents et adéquats (p. ex., cultures cellulaires in vitro, modèles de poumons sur puce, tranches de poumoncoupées de précision (PCLS)) ont été développés afin d’évaluer la toxicité par inhalation aigue des particules en suspension dans l’air5,7,10,11. En ce qui concerne les modèles de culture cellulaire in vitro, les cellules cultivées peuvent être exposées dans des conditions immergées ou à l’ALI (Figure 1). Cependant, la validité des études d’exposition submergée est limitée en ce qui concerne l’évaluation de la toxicité des composés en suspension dans l’air, en particulier les particules. Les techniques d’exposition submergée ne correspondent pas à la situation in vivo humaine; le milieu de culture cellulaire couvrant les cellules peut affecter les propriétés physico-chimiques et donc, les propriétés toxiques d’une substance d’essai12,13. Les modèles d’inhalation in vitro ALI permettent l’exposition directe des cellules aux substances d’essai sans interférence du milieu de culture cellulaire avec des particules d’essai, imitant ainsi l’exposition humaine avec une similitude physiologique et biologique plus élevée que les expositions submergées12,14.
Pour les processus réglementaires tels que REACH, cependant, seuls les modèles animaux sont disponibles dans le domaine de la toxicologie par inhalation aigue, car aucune autre méthode in vitro n’a été suffisamment validée et officiellement acceptée jusqu’à présent14. À cette fin, les modèles d’essai doivent être validés conformément aux exigences du Laboratoire de référence de l’Union européenne pour les principes d’alternatives à l’expérimentation animale (EURL-ECVAM) sur la validité des tests15.
Une ancienne étude de pré-validation et une étude de validation récemment terminée ont démontré avec succès la zone d’application du système d’exposition À la RFS DELET et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité13. Ce système d’exposition est un système d’exposition cellulaire in vitro qui permet une exposition homogène des cellules aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (p. ex. fumée de cigarette) à l’ALI en raison de son concept de distribution d’aérosols radiaux et de la conduction de l’aérosol d’essai dans un flux continu sur les cellules16. Le module de base de ce système d’écoulement radial se compose de l’adaptateur d’entrée, du module de guidage d’aérosol avec une distribution d’aérosols radiaux, du module d’échantillonnage et de prise, et d’un module de verrouillage avec une roue à main (Figure 2). Les particules générées atteignent les cellules par l’intermédiaire de l’adaptateur d’entrée et du module de guidage des aérosols et sont déposées sur les inserts de culture cellulaire, qui sont situés dans les trois chambres d’exposition radialement disposées du module d’échantillonnage. Le module de guidage des aérosols ainsi que le module d’échantillonnage peuvent être chauffés en se connectant à un bain d’eau externe17.
Dans le cadre des deux études, les cellules A549 ont été utilisées pour toutes les expériences d’exposition. La lignée cellulaire A549 est une lignée cellulaire épithéliale immortalisée par l’homme qui est très bien caractérisée et a été utilisée comme modèle in vitro pour les cellules épithéliales alvéoliennes de type II dans de nombreuses études toxicologiques. Les cellules sont caractérisées par des corps lamellar, la production de surfactant et un certain nombre de facteurs inflammation-pertinents18. Ils montrent également des propriétés des cellules épithéliales bronchiques en raison de leur production de mucus19. En outre, ils peuvent être cultivés à l’ALI. Bien que cette lignée cellulaire est déficiente dans la construction de contacts cellule-cellule, la culture de ces cellules est beaucoup plus pratique, moins coûteux et les résultats dérivés de celui-ci sont indépendants des donneurs par rapport aux cellules primaires20.
Les cellules A549 ont été enseventées dans des inserts de culture cellulaire de 6 puits (membrane DE PET, 4,67 cm2, taille de pore 0,4 mm) avec une densité de 3,0 x 105 cellules par insert et cultivées pendant 24 h dans des conditions immergées. Les cellules ont ensuite été exposées dans trois laboratoires indépendants à l’air pur et à trois doses d’exposition différentes (25, 50 et 100 ‘g/cm2) de 20 substances d’essai à l’ALI. La dose d’exposition est corrélée au temps de dépôt, ce qui entraîne un taux de particules constants de 25 g/cm2,50 g/cm2 et 100 g/cm2 sur les cellules après 15, 30 ou 60 min, respectivement. Les particules déposées, cependant, n’ont pas été lavées après dépôt, mais sont restées sur les cellules pendant 24 h. Les temps de dépôt des particules étaient donc de 15, 30 et 60 min, mais l’exposition des cellules a duré 24 h au total. Le taux de dépôt des substances d’essai a été déterminé dans des expériences préliminaires selon les méthodes précédentes17.
La viabilité cellulaire comme indicateur de toxicité a été évaluée 24 h après dépôt de particules à l’aide d’un exemple de viabilité cellulaire. Un accent particulier a été mis sur la qualité des contrôles de l’air pur, l’optimisation et le raffinement du protocole d’exposition, la reproductibilité intra- et inter-laboratoire et l’établissement d’un modèle de prévision (PM). Substances qui ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire en dessous de 50 % (PM 50 %) ou 75% (PM 75%) à l’une des trois doses d’exposition ont été considérées comme exerçant un risque aigu d’inhalation. Les résultats ont ensuite été comparés aux données in vivo existantes (basées sur au moins une étude fiable selon les lignes directrices des tests de l’OCDE (TG) 403 ou TG 43621,22), conduisant à une concordance globale de 85%, avec une spécificité de 83% et une sensibilité de 88%23.
Outre la mesure de la viabilité cellulaire, d’autres critères d’évaluation tels que la libération de cytokine, l’examen du lysate cellulaire ou l’intégrité de la membrane par l’analyse DeLH peuvent être évalués, mais n’ont pas été requis pour l’étude de validation. Ainsi, le système d’exposition (p. ex., LE RFS DE L’ESSAI DE CULTEX) a été prouvé comme un système de dépistage prédictif pour l’évaluation qualitative de la toxicité par inhalation aigue des particules testées dans l’air, ce qui représente une méthode alternative prometteuse à l’expérimentation animale. Le protocole suivant est recommandé pour les expériences d’exposition aux particules en suspension dans l’air à l’aide de ce système d’exposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale ont été développés ces dernières années afin d’obtenir des informations sur le risque aigu d’inhalation de particules inhalables et de réduire et de remplacer les expériences animales selon le principe 3R25.
En termes de modèles de culture cellulaire, l’exposition des cellules peut se faire dans des conditions immergées ou à l’ALI. L’exposition des cellules dans des conditions i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Allemagne (Grant 031A581, sous-projet A-D)) et par la Fondation allemande de la recherche (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Groupe de formation à la recherche GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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