जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
Summary
यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा की पूरी तैयारी में प्रोटीन का फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सामान्य विकास और रोग दोनों राज्यों के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। हालांकि स्तनधारी ऊतक और ऊतक वर्गों के लिए कई इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है, इन प्रोटोकॉलों को अक्सर गैर-स्तनधारी मॉडल जीवों के लिए संशोधन और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। जेब्राफिश का उपयोग विकास प्रक्रियाओं के आणविक, आनुवंशिक और सेल जैविक तंत्र की जांच करने के लिए बुनियादी, जैव चिकित्सा और ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक मॉडल प्रणाली के रूप में तेजी से किया जाता है। जेब्राफ़िश एक मॉडल प्रणाली के रूप में कई फायदे प्रदान करते हैं लेकिन इष्टतम प्रोटीन का पता लगाने के लिए संशोधित तकनीकों की भी आवश्यकता होती है। यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट फ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अपना प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से कई अलग-अलग बढ़ती रणनीतियों का वर्णन करता है जिन्हें नियोजित किया जा सकता है और प्रत्येक रणनीति प्रदान करने वाले लाभों और नुकसानों का अवलोकन करता है। हम इस प्रोटोकॉल में संशोधनों का भी वर्णन करते हैं ताकि पूरे माउंट ऊतक में गुणसूत्र सब्सट्रेट्स का पता लगाने और अनुभागित लार्वा ऊतकों में फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की अनुमति दी जा सके। यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कई विकासात्मक चरणों और भ्रूणीय संरचनाओं के अध्ययन पर लागू होता है।
Introduction
जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)कम पीढ़ी के समय, तेजी से विकास और आनुवंशिक तकनीकों के लिए amenability सहित कई कारणों से जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है । नतीजतन, जेब्राफिश का उपयोग आमतौर पर विष विज्ञान अनुसंधान और दवा की खोज के लिए उच्च थ्रूपुट छोटे अणु स्क्रीन में किया जाता है। जेब्राफिश विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल भी है कि एक महिला नियमित रूप से एक समय में 50-300 अंडे का उत्पादन कर सकती है और ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट भ्रूण विकास प्रक्रियाओं के कुशल दृश्य के लिए बाहरी रूप से विकसित होते हैं। हालांकि, शुरुआती शोध ज्यादातर रिवर्स जेनेटिक तकनीकों की स्थापना में चुनौतियों के कारण एन-एथिल-एन-नाइटरोसौरिया (ENU) या अन्य म्यूटगेन्स का उपयोग करके फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन पर भरोसा करते थे । मोटे तौर पर दो दशक पहले, मॉर्पोलिनोस का उपयोग पहले जेब्राफिश में लक्षित जीन1को नॉकआउट करने के लिए किया गया था। मॉर्पोलिनो छोटे एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स हैं जो शुरुआती विकास के चरण में भ्रूण में माइक्रोइंजेक्शन के बाद लक्ष्य एमआरएनए के अनुवाद को रोकते हैं। मॉर्फोलिनोस की एक बड़ी कमजोरी यह है कि वे कोशिकाओं को विभाजित करते हैं और आम तौर पर निषेचन (एचपीएफ) के बाद 72 घंटे तक प्रभावशीलता खो देते हैं। जबकि मॉर्फोलिनो जेब्राफिश जीन व्यवधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बने हुए हैं, प्रतिलेखन सक्रियकर्ता की तरह प्रभावक न्यूकलीज (TALENs), जिंक-फिंगर न्यूक्लोप्स (जेडएफएन), और क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPRs) का उपयोग हाल ही में जेब्राफिश जीनोम2,3को सीधे लक्षित करने के लिए किया जा रहा है। इन रिवर्स आनुवंशिक रणनीतियों, आगे आनुवंशिकी और उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के साथ संयोजन में, जीन अभिव्यक्ति और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में जेब्राफिश की स्थापना की है ।
जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को आम तौर पर जीन या जीन उत्पाद अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक वितरण के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक विकास के दौरान इस तरह के अभिव्यक्ति पैटर्न की कल्पना करने के लिए दो सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीक सीटू संकरण (ISH) और पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) में हैं। सीटू संकरण में पहली बार 1969 में विकसित किया गया था और एक जीव4में एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए लेबल एंटीसेंस आरएनए जांच के उपयोग पर निर्भर करता है । इसके विपरीत, लेबल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में किया जाता है। पता लगाने के लिए प्रोटीन लेबलिंग का विचार 1930 के5 को वापस तिथियां और पहला आईएचसी प्रयोग १९४१ में प्रकाशित किया गया था जब FITC लेबल एंटीबॉडी संक्रमित ऊतकों6में रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । ईश और आईएचसी बाद के दशकों में विकसित हुए हैं और इसमें काफी सुधार हुआ है और अब दोनों का उपयोग नियमित रूप से आणविक और नैदानिक अनुसंधान प्रयोगशाला7,8,9,10,11में किया जाता है । जबकि दोनों तकनीकों के फायदे और नुकसान हैं, आईएचसी ईश पर कई लाभ प्रदान करता है। व्यावहारिक रूप से, आईएचसी ईश की तुलना में बहुत कम समय लगता है और आम तौर पर प्राथमिक एंटीबॉडी की लागत के आधार पर कम महंगा होता है। इसके अलावा, एमआरएनए अभिव्यक्ति हमेशा प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक विश्वसनीय मीट्रिक नहीं होता है क्योंकि चूहों और मनुष्यों में यह प्रदर्शित किया गया है कि केवल एक तिहाई प्रोटीन बहुतायत भिन्नता को एमआरएनए बहुतायत12द्वारा समझाया जा सकता है। इस कारण से, आईएचसी ईश डेटा की पुष्टि करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक है, जब संभव हो। अंत में, आईएचसी उपकोशिकीय और सह-स्थानीयकरण डेटा प्रदान कर सकता है जिसे ईश13,14,15द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। यहां, हम पूरे माउंट जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्रोटीन का मज़बूती से पता लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करते हैं। इस तकनीक का लक्ष्य पूरे भ्रूण में ब्याज के प्रोटीन की स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का निर्धारण करना है। यह तकनीक एंटीजन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंटी टैग माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करती है। प्रोटोकॉल आसानी से स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों पर उपयोग करने के लिए और फ्लोरेसेंस के बदले गुणसूत्र सब्सट्रेट्स के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि जेब्राफ़िश कंकाल मांसपेशी विकसित करना एसिटाइलकोलिन रिसेप्टर्स के अलावा आयोनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है। एनएमडीए-प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर उपइकाइयों का 23 एचपीएफ पर देशीयकालीन मांसपेशी पर पता लगाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग किसी जीव में ब्याज के लगभग किसी भी प्रोटीन की स्थानिक-लौकिक अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग व…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच ग्रांट 8P20GM103436 14 से फंडिंग।
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neurosciences. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
