Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.
A imunohistoquímica é uma técnica amplamente utilizada para explorar a expressão e localização de proteínas durante os estados normais de desenvolvimento e doenças. Embora muitos protocolos de imunohistoquímica tenham sido otimizados para seções de tecido e tecido mamíferos, esses protocolos muitas vezes requerem modificação e otimização para organismos modelos não mamíferos. Os zebrafish são cada vez mais utilizados como um sistema modelo em pesquisas básicas, biomédicas e translacionais para investigar os mecanismos biológicos moleculares, genéticos e celulares dos processos de desenvolvimento. Os zebrafish oferecem muitas vantagens como um sistema modelo, mas também exigem técnicas modificadas para detecção ideal de proteínas. Aqui, fornecemos nosso protocolo de imunohistoquímica de fluorescência em embriões e larvas de zebrafish. Este protocolo descreve além várias diferentes estratégias de montagem que podem ser empregadas e uma visão geral das vantagens e desvantagens que cada estratégia proporciona. Também descrevemos modificações neste protocolo para permitir a detecção de substratos cromosgênicos em tecido de montagem inteiro e detecção de fluorescência no tecido larval seccional. Este protocolo é amplamente aplicável ao estudo de muitas etapas de desenvolvimento e estruturas embrionárias.
O zebrafish (Danio rerio) emergiu como um modelo poderoso para o estudo de processos biológicos por várias razões, incluindo curto tempo de geração, desenvolvimento rápido e comodidade às técnicas genéticas. Como resultado, os zebrafish são comumente usados em telas de moléculas pequenas de alto nível para pesquisa toxicológica e descoberta de drogas. Os zebrafish também são um modelo atraente para o estudo dos processos de desenvolvimento, dado que uma única fêmea pode produzir rotineiramente 50-300 ovos por vez e os embriões opticamente claros desenvolvem-se externamente permitindo uma visualização eficiente dos processos de desenvolvimento. No entanto, as primeiras pesquisas se basearam principalmente em telas genéticas avançadas usando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) ou outras mutagens devido a desafios no estabelecimento de técnicas genéticas reversas. Cerca de duas décadas atrás, morfinas foram usadas pela primeira vez em zebrafish para derrubargenes1 . Morfinas são pequenos oligonucleotídeos antisenseque inibem a tradução do alvo mRNA após microinjeção em um embrião em um estágio inicial de desenvolvimento. Uma grande fraqueza dos morfolinos é que eles são diluídos à medida que as células se dividem e geralmente perdem eficácia por 72 horas após a fertilização (hpf). Enquanto morfinanos continuam sendo uma ferramenta poderosa para a interrupção do gene zebrafish, os núcleos eficazes ou causadors de transcrição (TALENs), núcleos de zinco-finger (ZFNs) e repetos curtos e regularmente interespaçados (CRISPRs) estão sendo usados mais recentemente para atingir diretamente o genoma do zebrafish2,3. Essas estratégias genéticas reversas, combinadas com a genética avançada e telas de alto nível, estabeleceram o zebrafish como um modelo poderoso para estudar a expressão genética e a função.
A capacidade de estudar a função genética geralmente requer uma avaliação da distribuição spatio-temporal da expressão do produto genético ou genético. As duas técnicas mais utilizadas para visualizar tais padrões de expressão durante o desenvolvimento precoce estão na hibridização situ (ISH) e toda a imunohistoquímica do monte (IHC). No situ a hibridização foi desenvolvida pela primeira vez em 1969 e conta com o uso de sondas de RNA antisense rotuladas para detectar a expressão mRNA em um organismo4. Em contraste, anticorpos rotulados são usados na imunohistoquímica para visualizar a expressão proteica. A ideia de rotular proteínas para detecção remonta aosanos 5 da década de 1930 e o primeiro experimento iHC foi publicado em 1941, quando anticorpos rotulados pela FITC foram usados para detectar bactérias patogênicas em tecidos infectados6. Ish e IHC evoluíram e melhoraram significativamente nas décadas seguintes e agora são utilizados rotineiramente no laboratório de pesquisa molecular e diagnóstico7,8,9,10,11. Embora ambas as técnicas tenham vantagens e desvantagens, o IHC oferece vários benefícios sobre o ISH. Na prática, o IHC é muito menos demorado do que o ISH e geralmente é menos caro dependendo do custo do anticorpo primário. Além disso, a expressão mRNA nem sempre é uma métrica confiável de expressão proteica como tem sido demonstrado em camundongos e humanos que apenas cerca de um terço da variação de abundância de proteínas pode ser explicada pela abundância mRNA12. Por essa razão, o IHC é um suplemento importante para confirmar os dados ish, quando possível. Finalmente, o IHC pode fornecer dados subcelulares e de colocalização que não podem ser determinados pelo ISH13,14,15. Aqui, descrevemos um método passo a passo para detectar de forma confiável proteínas por imunohistoquímica em embriões e larvas de zebrafish de monte inteiro. O objetivo desta técnica é determinar a expressão espacial e temporal de uma proteína de interesse em todo o embrião. Esta tecnologia utiliza anticorpos primários específicos de antígenos e anticorpos secundários fluorescentes marcados. O protocolo é prontamente adaptável para usar em seções de tecido montados em slides e para uso com substratos cromosgênicos em vez de fluorescência. Usando este protocolo, demonstramos que o desenvolvimento de músculos esqueléticos de zebrafish expressa receptores glutamato ionotrópicos, além de receptores de acetilcolina. Subunidades receptoras glutamato do tipo NMDA são detectáveis no músculo longitudinal a 23 hpf.
Imunohistoquímica é uma ferramenta versátil que pode ser usada para caracterizar a expressão spatio-temporal de praticamente qualquer proteína de interesse em um organismo. A imunohistoquímica é usada em uma grande variedade de tecidos e organismos modelo. Este protocolo foi otimizado para uso em zebrafish. A imunohistoquímica em diferentes espécies pode exigir diferentes técnicas de fixação e manuseio, bloqueando soluções dependendo das espécies e a presença de peroxidases endógenas, e tempos de incuba?…
The authors have nothing to disclose.
Financiamento do NIH conceder 8P20GM103436 14.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
Microwave oven | Toastmaster | ||
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superglue gel | 3M Scotch | ||
TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |