Procesoptimering ved hjælp af høj gennemløb automatiseret mikro-bioreaktorer i kinesisk Hamster Ovary Cell Dyrkning
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret procedure til at køre et eksperimentdesign i en automatiseret mikrobioreaktor efterfulgt af cellehøst og proteinkvantificering ved hjælp af en Protein A kolonne.
Abstract
Optimering af bioprocesser for at øge udbyttet af ønskede produkter er af betydning i den biofarmaceutiske industri. Dette kan opnås ved at udvælge stammen og ved at udvikle bioprocesparametre. Der er anvendt rystekolber til dette formål. De mangler dog evnen til at styre procesparametre som pH og opløst ilt (DO). Denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af en automatiseret mikrobioreaktor. Disse bioreaktorer efterligner dyrkning i større skala. En af de største fordele ved dette system er integrationen af Design of Experiment (DOE) i softwaren. Denne integration gør det muligt at etablere et design, hvor flere procesparametre kan varieres samtidigt. De kritiske procesparametre og optimale bioprocesbetingelser kan analyseres i softwaren. Fokus for det arbejde, der præsenteres her, er at introducere brugeren til de trin, der er involveret i processen design i softwaren og indarbejdelse af DOE inden for dyrkning køre.
Introduction
Det globale biofarmaceutiske marked var mere værd end 250 milliarder dollar i 2018 og har løbende ekspanderet1. Medicinalvirksomheder bevæger sig væk fra at producere små molekylære lægemidler til bioteknologisk fremstillede terapeutiske såsom rekombinant proteiner. Disse alene er ansvarlige for en omsætning på mere end $ 150 milliarder1. Pattedyrceller anvendes nu i udstrakt grad til fremstilling af disse farmaceutiske rekombinantproteiner. I den nuværende periode, blandt de 68 godkendte produkter produceret af pattedyrceller, 57 er produceret af kinesiske Hamster æggestok celler (CHO)2. CHO celler anvendes specielt til produktion af rekombinant proteiner, der kræver post-translationelle ændringer. Disse celler foretrækkes , efterhånden som de vokser i en suspension og derved muliggør reproducerbare resultater i et serumfrit kemisk defineret medium3,4. Den anden fordel ved at bruge CHO-celler er, at produktets glykoliske struktur ligner det humane monoklonale antistof (mAb) og resulterer i højere rekombinant proteinudbytte og specifik produktivitet på grund af genforstærkning5.
Udbyttet af rekombinant CHO (rCHO) cellekultur er steget med hundrede gange i de seneste to årtier. Denne forbedring tilskrives optimering af procesparametre, fodringsstrategi og udvikling af serumfrit kemisk defineret medium6. Med stigningen i kravene til de farmaceutiske produkter, presset stiger på omkostninger og tid effektivitet for udviklingen af produktionsprocessen7. For at reducere presset og samtidig sikre produktkvaliteten har omdirigeret fokus for den farmaceutiske industri på Quality by Design (QbD). QbD bruges til at forstå produktproduktionen såvel som processen. Et vigtigt værktøj, der anvendes i OBD er Design of Experiment (DOE). Det hjælper med at øge forståelsen af processen ved at afsløre forholdet mellem forskellige input variabler og resulterende output data. Anvendelse af DOE-metoden til optimering af bioprocessen er gavnligt i de tidlige faser af projektet ved at sidestilles procesbetingelserne og øge titerket og -kvaliteten. Denne tilgang er gavnlig i forhold til den gammeldags strategi: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistiske tilgange til DOE ved hjælp af klassisk, Shainin eller Taguchi er langt bedre end OFAT8.
Processen og medieoptimeringen kan udføres i rystekolber. Kolberne er relativt billige. Det er dog ikke muligt at styre parametre som temperatur, pH og opløst ilt (DO). For at overvinde disse ulemper kan multiuse bench-top bioreaktorer lige fra arbejdsvolumen på 0,5 L til 5 L anvendes. Reaktorerne giver en omfattende on-line overvågning og proceskontrol. Men brugen af multiuse bioreaktor er tid og arbejdskrævende. For at overvinde disse ulemper anvendes en ny engangsbioreaktor, der kombinerer den omfattende proces med overvågning af bioreaktoren på bænken og nem håndtering af rystekolben. Det høje gennemløbsscreeningssystem og engangsteknologi har bidraget til at øge effektiviteten af procesydeevne og -udvikling9.
I denne artikel er retningslinjerne for at indlæse opskriften i den automatiserede mikrobioreaktorsoftware (AMBR) listet. Indflydelsen af forskellige omrørerhastigheder og pH på den levedygtige cellekoncentration (VCC) og titer undersøges i løbet af dette forsøg. Det eksperimentelle resultat og analysen udføres med design af eksperimentsoftware MODDE 12. Produktanalyserne udføres i et højtryksvæskekromatografisystem (HPLC) med en Protein A-kolonne. Den er baseret på princippet om , at fc-regionen af mAb binder sig til protein A med høj affinitet10,11. Med denne metode er det muligt at identificere og kvantificere mAb. Kvantificeringen foretages over de målte elueringsområder ved 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimering af processen for at øge udbyttet er af afgørende betydning i den biofarmaceutiske industri. Rystekolber kan potentielt anvendes til screening af stammen; Overvågningen af procesparametresom pH og DO er dog ikke tilgængelig i kolberne. Mikrobioreaktorerne har en fordel, da de giver mulighed for løbende overvågning og kontrol af processen. Disse kontrolsløjfer i mikrobioreaktoren giver også en tilstand svarende til dem i større skala og giver således resultater, der kan sammenlignes med de større bior…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), forbundsministeriet for uddannelse og forskning, Tyskland, og BioProcessing-teamet under Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, for deres støtte.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
