מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר
Summary
כאן, אנו מציגים הליך מפורט כדי להריץ עיצוב של ניסוי במיקרו-bioreactor חקן אוטומטי ואחריו הקציר התאים וכימות החלבון באמצעות חלבון A עמודה.
Abstract
אופטימיזציה של bioprocesses כדי להגדיל את התשואה של המוצרים הרצויים היא חשיבות בתעשיית הביופרמקולוגיה. זה יכול להיות מושגת על ידי בחירת המתח ועל ידי פיתוח ביוברוזה פרמטרים. מבחנות לנער שימשו למטרה זו. הם, עם זאת, חוסר יכולת לשלוט בפרמטרים התהליך כגון pH ו חמצן מומס (DO). מגבלה זו ניתן להתגבר בעזרת מיקרו-ביוריאקטור אוטומטי. השחקנים האלה מחקים את הטיפוח בקנה מידה גדול יותר. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא שילוב של עיצוב הניסוי (DOE) בתוכנה. שילוב זה מאפשר יצירת עיצוב שבו ניתן לגוון במקביל פרמטרי תהליך מרובים. ניתן לנתח את פרמטרי התהליך הקריטי ואת תנאי הביוברוזה האופטימליים בתוך התוכנה. מוקד העבודה המוצג כאן הוא להחדיר את המשתמש לצעדים המעורבים בעיצוב התהליך בתוכנה ובשילוב של ה-DOE במהלך הטיפוח-תרגול.
Introduction
השוק הביופרמקולוגיה העולמי היה שווה יותר מאשר ארה ב $250,000,000,000 בשנת 2018 והרחיבה ברציפות1. חברות התרופות מתרחק מהפקת תרופות מולקולריות קטנות לtherapeutics המיוצרים בביוטכנולוגית כגון חלבונים רקומביננטי. אלה בלבד אחראים על הכנסות של יותר מ $150,000,000,0001. התאים המיונקים נמצאים כעת בשימוש נרחב לייצור של אלה רקומביננטי תרופות חלבונים. בתקופה הנוכחית, בין 68 מוצרים מאושרים שיוצרו על ידי תאים מיונקים, 57 מיוצרים על ידי תאי שחלות בסינית אוגר (CHO)2. תאים צ’ו משמשים במיוחד עבור ייצור של חלבונים רקומביננטי הדורשים שינויים פוסט-טרנסלבותית. תאים אלה הם מועדפים כפי שהם גדלים השעיה ובכך לאפשר תוצאות הנוזלה בסרום חינם מוגדר כימית בינונית3,4. היתרון השני של שימוש בתאי צ’ו הוא כי גליקן המבנה של המוצר דומה לזה של הנוגדן מונובטיים האנושי (mAb) ותוצאות תשואה גבוהה יותר חלבון רקומביננטי ופרודוקטיביות ספציפית בשל הגברה ג’ין5.
התשואה של תרבות התאים רקומביננטי CHO (rCHO) הוגדלה על-ידי פי מאה בשני העשורים האחרונים. שיפור זה מיוחס לאופטימיזציה של הפרמטרים התהליך, האכלה אסטרטגיה ופיתוח של סרום מוגדר כימית ללא תשלום בינונית6. עם העלייה בדרישות של מוצרי התרופות, הלחץ עולה על יעילות הזמן לפיתוח של תהליך הייצור7. כדי להפחית את הלחץ תוך הבטחת איכות המוצר הנותבת מחדש את המוקד של תעשיית התרופות על איכות ידי עיצוב (QbD). QbD משמש כדי להבין את ייצור המוצר, כמו גם את התהליך. כלי חיוני המשמש את ObD הוא העיצוב של הניסוי (DOE). היא מסייעת להגברת ההבנה של התהליך על-ידי חשיפת הקשר בין משתני קלט שונים ונתוני פלט שנוצרו. החלת הגישה DOE כדי למטב את הביומיזם הוא מועיל במהלך השלבים המוקדמים של הפרויקט בהטמעת תנאי התהליך והגדלת כמות סיכוייו ואיכות. גישה זו מועילה בהשוואה לאסטרטגיה המיושנת: גורם אחד-בזמן (OFAT). הגישות הסטטיסטיות ב-DOE באמצעות הקלאסיקה, שנין או טאגוצ’י מעולים בהרבה על ה-OFAT8.
מיטוב התהליך והמדיה ניתן לבצע בצלוחיות טלטול. מבחנות הם זולים יחסית. עם זאת, לא ניתן לשלוט בפרמטרים כגון טמפרטורה, pH ו חמצן מומס (DO). כדי להתגבר על החסרונות האלה, שימוש רב הספסל ריאקטורים העליון החל נפח עבודה של 0.5 l ל 5 l ניתן להשתמש. הכורים מספקים מעקב נרחב ובקרת תהליכים מקוונים. עם זאת, השימוש בביוריאקטור רב השימוש הוא זמן ועבודה אינטנסיבית. על מנת להתגבר על החסרונות האלה, ביוריאקטור הרומן היחיד המשלב את התהליך המקיף של ניטור ביוריאקטור הספסל העליון וטיפול קל של הבקבוקון משמש. מערכת הסינון של תפוקה גבוהה וטכנולוגיה לשימוש יחיד תרמו כדי לשפר את היעילות של ביצועי תהליך ופיתוח9.
במאמר זה, ההנחיות לטעון את המתכון בתוכנת מיקרו-ביוריאקטור האוטומטי (AMBR) מפורטים. ההשפעה של מהירויות שונות של שטירר ו-pH על ריכוז התא קיימא (vcc) ו סיכוייו הוא למד במהלך הניסוי הזה. התוצאה והניתוח הנסיוני מתבצעים בתכנון תוכנת הניסוי MODDE 12. ניתוח המוצר מבוצע במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות) עם עמודת חלבון A. הוא מבוסס על העיקרון כי האזור הFc של mAb נקשר חלבון A עם אהדה גבוהה10,11. בשיטה זו, ניתן לזהות ולכמת את mAb. הקוונפיקציה מתבצעת מעל האזורים השיא הנמדד שנמדדו ב 280 ננומטר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אופטימיזציה של התהליך כדי להגדיל את התשואה היא בעלת חשיבות מכרעת בתעשיית הביופרמקולוגיה. מבחנות לנער עלול לשמש להקרנה של המתח; עם זאת, הניטור של הפרמטרים התהליך כגון pH ו-DO אינם זמינים בצלוחיות. המיקרו-ביוריאקטורים יש יתרון כפי שהם מאפשרים ניטור רציפה ושליטה על התהליך. לולאות שליטה אלה במי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לBundesministerium הבילפות ולפורשנג (BMBF), משרד החינוך והמחקר הפדרלי, גרמניה וצוות הביו-ביוטכנולוגיה של הקבוצה הביוטוריוס, בגרמניה, על תמיכתם.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
