중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화
Summary
여기에서, 우리는 단백질 A 열을 사용하여 세포 수확 및 단백질 정량화에 선행된 자동화된 마이크로 bioreactor에 있는 실험의 디자인을 실행하는 상세한 절차를 제시합니다.
Abstract
원하는 제품의 수율을 높이기 위해 바이오 공정의 최적화는 바이오 제약 산업에서 중요합니다. 이것은 변형 률 선택과 생물 공정 매개 변수를 개발하여 달성 할 수 있습니다. 이 목적을 위해 사용 된 쉐이크 플라스크. 그러나, 그들은 pH 및 용존 산소 (DO)와 같은 공정 파라미터를 제어 할 수있는 능력이 부족합니다. 이러한 한계는 자동화된 마이크로 바이오리액터의 도움으로 극복될 수 있다. 이러한 생물 반응기는 더 큰 규모로 재배를 모방합니다. 이 시스템의 주요 장점 중 하나는 소프트웨어에 실험 설계(DOE)를 통합하는 것입니다. 이러한 통합을 통해 여러 공정 파라미터를 동시에 변경할 수 있는 설계를 수립할 수 있습니다. 중요한 공정 파라미터와 최적의 바이오 공정 조건을 소프트웨어 내에서 분석할 수 있습니다. 여기에 제시된 작업의 초점은 재배 실행 내에서 DOE의 소프트웨어 및 통합에서 프로세스 설계와 관련된 단계를 사용자에게 소개하는 것입니다.
Introduction
글로벌 바이오 의약품 시장은 2018년에 2,500억 달러 이상의 가치를 지니고 있으며 지속적으로1개사업을 확장하고 있습니다. 제약 회사들은 작은 분자 약물을 생산하는 것에서 재조합 단백질과 같은 생명 공학적으로 생산된 치료제로 옮겨가고 있습니다. 이들 만이 1,500억 달러 이상의 수익을 책임지고있습니다. 포유류 세포는 이제 이러한 약제학적 재조합 단백질의 생산에 광범위하게 사용된다. 현재 포유류 세포에 의해 생산된 68개의 승인된 제품 중 57개는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)에 의해 생산된다2. CHO 세포는 특히 번역 후 수정을 필요로 하는 재조합 단백질의 생산에 사용됩니다. 이들 세포는 현탁액에서 성장함에 따라 바람직하며, 이에 따라 화학적으로 정의된 배지3,,4. CHO 세포를 사용하는 또 다른 장점은 생성물의 글리칸 구조가 인간 단일클론 항체(mAb)의 글리칸 구조와 유사하고 유전자 증폭5로 인한 재조합 단백질 수율 및 특이적 생산성을 초래한다는것이다.
재조합 CHO (rCHO) 세포 배양의 수율은 지난 2 년간 백 배 증가했습니다. 이러한 개선은 공정 파라미터의 최적화, 공급 전략 및 화학적으로 정의된 배지6의혈청 자유의 개발에 기인한다. 의약품의 요구 사항의 증가와 함께, 생산 공정의 개발을위한 비용 및 시간 효율에 대한 압력이 증가7. 제품 품질을 보장하면서 압력을 줄이기 위해 설계 품질 (QbD)에 제약 산업의 초점을 리디렉션했습니다. QbD는 제품 생산과 공정을 이해하는 데 사용됩니다. ObD에 사용되는 중요한 도구는 실험 설계(DOE)입니다. 다양한 입력 변수와 결과 출력 데이터 간의 관계를 표시하여 프로세스에 대한 이해를 높이는 데 도움이 됩니다. 생물 공정을 최적화하기 위해 DOE 접근법을 적용하는 것은 공정 조건을 동화하고 적조기 수량 및 품질을 증가시키는 프로젝트의 초기 단계에서 유용합니다. 이 방법은 구식 전략인 한 번에 한 단계(OFAT)와 비교할 때 유용합니다. 고전, 샤인 또는 타구치를 사용하여 DOE에 대한 통계적 접근 방식은 OFAT8보다훨씬 우수합니다.
프로세스 및 미디어 최적화는 쉐이크 플라스크에서 수행할 수 있습니다. 플라스크는 상대적으로 저렴합니다. 그러나 온도, pH 및 용존 산소(DO)와 같은 파라미터를 제어할 수 없습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 0.5L ~ 5L의 작업량에 이르는 다용도 벤치탑 바이오리액터를 사용할 수 있습니다. 반응기는 광범위한 온라인 모니터링 및 공정 제어를 제공합니다. 그러나, 다용도 바이오리액터의 사용은 시간과 노동 집약적이다. 이러한 단점을 극복하기 위해 벤치탑 바이오리액터와 쉐이크 플라스크의 손쉬운 취급을 모니터링하는 포괄적인 공정을 결합한 새로운 일회용 바이오리액터가 사용된다. 높은 처리량 스크리닝 시스템과 일회용 기술은 공정 성능 및 개발의 효율성을 향상시키는 데기여했습니다 9.
이 문서에서는 자동화된 마이크로 바이오리액터(AMBR) 소프트웨어에 레시피를 로드하는 지침이 나열되어 있습니다. 이 실험의 과정에서 상이한 교반기 속도 및 pH가 생존 가능한 세포 농도(VCC) 및 기중기에 미치는 영향이 연구된다. 실험 결과 및 분석은 실험 소프트웨어 MODDE 12의 설계로 수행된다. 제품 분석은 단백질 A 컬럼이 있는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에서 수행됩니다. mAb의 Fc 영역이 높은 친화성10,,11을가진 단백질 A에 결합한다는 원리에 기초한다. 이 방법을 사용하면 mAb를 식별하고 정량화할 수 있습니다. 정량화는 280 nm에서 측정된 용출 피크 영역에 걸쳐 수행된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수율을 높이기 위한 공정의 최적화는 바이오 제약 산업에서 매우 중요합니다. 쉐이크 플라스크는 잠재적으로 균주의 스크리닝에 사용될 수 있다; 그러나 pH 및 DO와 같은 공정 파라미터의 모니터링은 플라스크에서 사용할 수 없습니다. 마이크로 바이오리액터는 공정을 지속적으로 모니터링하고 제어할 수 있다는 장점이 있습니다. 마이크로 바이오리액터의 이러한 제어 루프는 또한 더 큰 규모의 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 분데스장관 퓌르 빌둥 und Forschung (BMBF), 교육 및 연구의 연방 정부, 독일, 그리고 사르토리우스 스테딤 생명 공학 GmbH의 바이오 프로세싱 팀에 감사드립니다, 독일, 그들의 지원에 대한.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
