Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток
Summary
Здесь мы представляем подробную процедуру для запуска проекта эксперимента в автоматизированном микро-биореакторе с последующим сбором клеток и количественной оценкой белка с помощью столбца Protein A.
Abstract
Оптимизация биопроцессов для повышения урожайности желаемых продуктов имеет важное значение в биофармацевтической промышленности. Это может быть достигнуто путем выбора штамма и разработки параметров биопроцесса. Для этой цели были использованы встряхивания. Однако у них нет возможности контролировать параметры процесса, такие как рН и растворенный кислород (DO). Это ограничение можно преодолеть с помощью автоматизированного микро-биореактора. Эти биореакторы имитируют культивирование в больших масштабах. Одним из основных преимуществ этой системы является интеграция дизайна эксперимента (DOE) в программное обеспечение. Эта интеграция позволяет создать дизайн, в котором несколько параметров процесса могут изменяться одновременно. Критические параметры процесса и оптимальные условия биопроцесса могут быть проанализированы в рамках программного обеспечения. Основное внимание в работе, представленной здесь, заключается в том, чтобы познакомить пользователя с шагами, участвующими в разработке процесса в программном обеспечении и включении DOE в рамках культивирования перспективе.
Introduction
Мировой рынок биофармацевтической продукции в 2018 году составил более 250 миллиардов долларов США, и он постоянно расширяется на1. Фармацевтические компании переходят от производства небольших молекулярных препаратов к биотехнологически милиемым терапевтическим препаратам, таким как рекомбинантные белки. Только они несут ответственность за доход более $ 150 млрд1. Клетки млекопитающих в настоящее время широко используются для производства этих фармацевтических рекомбинантных белков. В текущем периоде, среди 68 утвержденных продуктов, производимых клетками млекопитающих, 57 производятся китайскими клетками яичников хомяка (CHO)2. Клетки CHO специально используются для производства рекомбинантных белков, которые требуют посттрансляционных модификаций. Эти клетки являются предпочтительными, поскольку они растут в подвеске и тем самым позволяют воспроизводимые результаты в сыворотке свободной химически определены среды3,4. Другим преимуществом использования клеток CHO является то, что гликановая структура продукта напоминает структуру моноклональных антител человека (mAb) и приводит к более высокой урожайности рекомбинантного белка и специфической продуктивности благодаря усилению гена5.
Урожайность рекомбинантной культуры клеток CHO (rCHO) за последние два десятилетия увеличилась в сто раз. Это улучшение связано с оптимизацией параметров процесса, стратегией кормления и развитием сыворотки свободной химически определенной среды6. С увеличением требований к фармацевтической продукции повышается нагрузка на стоимость и эффективность времени развития производственного процесса7. Для снижения давления при обеспечении качества продукции переориентируется внимание фармацевтической промышленности на качество по дизайну ( qbD). Для понимания производства продукции, а также процесса используется bD. Важным инструментом, используемым в ObD является дизайн эксперимента (DOE). Это помогает повысить понимание процесса, раскрывая взаимосвязь между различными переменными ввода и полученными выходными данными. Применение подхода МЭ для оптимизации биопроцесса выгодно на ранних стадиях проекта в усвоении условий процесса и повышении количества и качества титра. Такой подход выгоден по сравнению со старомодной стратегией: «один фактор в то время» (OFAT). Статистические подходы к DOE с использованием классических, Shainin или Taguchi намного превосходит OFAT8.
Процесс и оптимизация мультимедиа могут быть выполнены в встряхивания колбы. Фляги относительно недорогие. Однако невозможно контролировать такие параметры, как температура, рН и растворенный кислород (DO). Для преодоления этих недостатков можно использовать многофункциональные биореакторы на скамейке от 0,5 л до 5 л. Реакторы обеспечивают обширный он-лайн мониторинг и контроль процессов. Тем не менее, использование многофункционального биореактора является трудоемким и трудоемким. Для того, чтобы преодолеть эти недостатки, используется новый одноразовый биореактор, который сочетает в себе комплексный процесс мониторинга биореактора на скамейке и простой обработки колбы для встряхивания. Высокая пропускная способность системы скрининга и одноразовые технологии способствовали повышению эффективности производительности процесса и развития9.
В этой статье перечислены рекомендации по загрузке рецепта в автоматизированное программное обеспечение для микробиореактора (AMBR). В ходе этого эксперимента изучается влияние различных скоростей и рН на жизнеспособную концентрацию клеток (VCC) и титр. Экспериментальный результат и анализ проводятся с разработкой экспериментального программного обеспечения MODDE 12. Анализ продукта осуществляется в жидкой хроматографии высокого давления (HPLC) с колонкой Protein A. Он основан на принципе, что FC области mAb связывается с белком А с высоким сродством10,11. С помощью этого метода можно определить и количественно mAb. Количественная оценка проводится в измеренных пиковых зонах элюции на уровне 280 нм.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимизация процесса повышения урожайности имеет решающее значение в биофармацевтической промышленности. Встряхивание колбы потенциально могут быть использованы для скрининга штамма; однако, мониторинг параметров процесса, таких как рН и DO, недоступен в колбах. Микро-биореакторы им?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Бундесминистриум Фюр Бильдунг и Форшунг (BMBF), Федеральное министерство образования и исследований, Германия, и BioProcessing команды Сарториус Stedim Biotech GmbH, Германия, за их поддержку.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
