تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم
Summary
لتحديد المنظمين الرواية من عوامل النسخ، وضعنا نهجا لفحص صفيفlentiviral أو retroviral المكتبات RNAI باستخدام النسخ المزدوج القائم على luciferase. هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لفحص مئات المرشحين في تجربة واحدة.
Abstract
يمكن لعوامل النسخ تغيير التعبير عن العديد من الجينات المستهدفة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من العمليات المصب مما يجعلها أهدافا جيدة للعلاجات المضادة للسرطان. ومع ذلك، استهداف عوامل النسخ مباشرة غالباً ما يكون صعباً ويمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية إذا كان عامل النسخ ضروري في واحد أو أكثر من أنسجة البالغين. تحديد المنظمين المنبع التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ في الخلايا السرطانية يقدم بديلا أكثر جدوى، لا سيما إذا كانت هذه البروتينات سهلة للدواء. هنا ، نحن نصف بروتوكول يمكن استخدامه للجمع بين المكتبات المتوسطة النطاق على نطاق واسع والمكتبات ذات النسخة المزدوجة اللوسيفاز القائمة على القول لتحديد المنظمين الرواية لعوامل النسخ في الخلايا السرطانية. يقدم نهجنا طريقة سريعة وسهلة وغير مكلفة لاختبار مئات الجينات في تجربة واحدة. لإثبات استخدام هذا النهج، قمنا بإجراء شاشة مكتبة RNAI مصفّى تحتوي على العديد من المنظمين للبروتين المرتبط بنعم (YAP) والنسخ المشارك المنشط مع عزر PDZ-ملزمة (TAZ)، واثنين من المنشطات المشتركة النسخ التي هي تأثيرات المصب لمسار فرس النهر. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا النهج لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا أو العامل المشارك ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص CRISPR/CAS9، cDNA، أو مكتبات ORF.
Introduction
والغرض من هذا القول هو استخدام المكتبات الفيروسية لتحديد المنظمين لعوامل النسخ بطريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة. ويرتبط النشاط النسخ الشاذ مع السرطان والانبثاث1،2،3،4،5،6، لذلك استهداف عوامل النسخ في الخلايا السرطانية هو نهج علاجي واعد. ومع ذلك، غالباً ما تكون عوامل النسخ صعبة لاستهداف الأدوية7 وكثير مطلوبة لوظيفة الخلوية العادية في أنسجة الكبار8,9,10. استهداف المسارات المرتبطة بالسرطان التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ لدفع المرض هو نهج أكثر جدوى مع احتمال أن يكون لها آثار جانبية أقل حدة. يتيح التوافر التجاري لـ RNAi أو CRISPR/CAS9 أو cDNA أو مكتبات ORF للباحثين اختبار أهمية العديد من الجينات في تجربة واحدة. ومع ذلك، يلزم قراءة موثوقة لنشاط النسخ المتغير.
هنا، نحن نصف استخدام فحص مراسل النسخ القائم على اللوسيفراز المزدوج والمكتبات المصصفوفة للصفات للبروتينات التي تنظم عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. في هذا القول، يتم تسليم shRNAs التي تستهدف الجينات المرتبطة بالسرطان إلى الخلايا السرطانية الثديية عن طريق نقل الفيروس lentiviral ويتم اختيار الخلايا للتكامل المستقر باستخدام البورومايسين. يتم نقل الخلايا بعد ذلك مع بناء مراسل الذي يعبر عن اليراعات luciferase يقودها مروج محددة لعامل النسخ التي يجري التحقيق فيها وبناء التحكم الذي يعبر عن رينيلا luciferase من المروج نشطة بشكل تأسيسي التي لا تستجيب لعامل النسخ يجري التحقيق. نحن نبرهن على هذا النهج مع شاشة إثبات المفهوم للمنظمين من YAP و TAZ ، والآثار الحاسمة المصب لمسار فرس النهر8،10،11. نشاط غير طبيعي من YAP وTAZ يعزز عدة خطوات من سلسلة منالمنق11 ويلاحظ في العديد من أنواع السرطان11,12,13. ومع ذلك، كيف YAP وTAZ تصبح تنشيط بشكل خاطئ في بعض الخلايا السرطانية لم يفهم تماما بعد. YAP وTAZ لا تربط الحمض النووي، ولكن بدلا من ذلك يتم تجنيدهم إلى المروجين من قبل عوامل النسخ الأخرى. أعضاء عائلة مجال الشاي (TEAD) من عوامل النسخ هي الشركاء ملزمة الرئيسية لYAP وTAZ، وحاسمة بالنسبة لمعظم YAP وTAZ تعتمد على الوظائف. لدينا بناء مراسل يعبر عن luciferase اليراعات من YAP / TAZ-TEAD استجابة المروج والدراسات السابقة أظهرت أنه يكشف بأمانة التغيرات في YAP-TEAD وTAZ-TEAD نشاط النسخ2،14،15.
نهجنا سريع ومتوسط الإنتاجية، ولا يتطلب مرافق فحص، روبوتات آلية، أو تسلسل عميق للمكتبات المجمعة. التكاليف منخفضة نسبيا وهناك العديد من المكتبات المتاحة تجاريا للاختيار من بينها. كما أن المعدات والكواشف المطلوبة قياسية نسبيا في معظم المختبرات. ويمكن استخدامه لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا إذا كان المراسل القائم على luciferase موجود أو تم إنشاؤه. نحن نستخدم هذا النهج لفحص shRNAs في الخلايا السرطانية، ولكن أي خط الخلية التي يمكن أن تكون مصابة بكفاءة معقولة يمكن استخدامها مع أي نوع من مكتبة صفيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، ونحن نظهر نهجا للفرز المتوسطة الإنتاجية للمكتبات الفيروسية مصفوفة في تركيبة مع الازدواج ية القائمة على النسخة القائمة على القول مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد واختبار المنظمين رواية من عوامل النسخ. من الأهمية بمكان توصيف وتحسين نظام المراسل لكل خط خلية قبل أي شاشة. وين…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر إميلي نورتون وميكايلان كوتشياري – ستوليسغروس على المساعدة في إعداد ناقلات shRNA. وقد دعم هذا العمل جزئيا ً منحة سوزان ج. كومن المحفز المهني التي منحت لـ J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Biologie du développement. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Recherche en cancérologie. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Recherche en cancérologie. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Recherche en cancérologie. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Recherche en cancérologie. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
