Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase
Summary
Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.
Abstract
Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.
Introduction
Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler pharmacologiquement7 et beaucoup sont nécessaires pour la fonction cellulaire normale dans les tissus adultes8,9,10. Cibler les voies associées au cancer qui activent aberrantement les facteurs de transcription pour conduire la maladie est une approche plus faisable avec le potentiel d’avoir des effets secondaires moins graves. La disponibilité commerciale des bibliothèques RNAi lentiviral et rétroviral à réseau, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF permet aux chercheurs de tester l’importance de nombreux gènes dans une seule expérience. Cependant, une lecture fiable pour l’activité transcriptionnelle altérée est exigée.
Ici, nous décrivons l’utilisation d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase et de bibliothèques lentiviral à la rangée pour identifier les protéines qui régulent les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Dans cet essai, les shARN qui ciblent les gènes cancéreux sont livrés aux cellules cancéreuses des mammifères par transduction lentivirale et les cellules sont sélectionnées pour une intégration stable à l’aide de puromycine. Les cellules sont ensuite transfected avec une construction de journaliste qui exprime la luciferase de luciole conduite par un promoteur spécifique au facteur de transcription qui est étudié et une construction de contrôle qui exprime Renilla luciferase d’un promoteur constitutivement actif qui n’est pas sensible au facteur de transcription à l’étude. Nous démontrons cette approche avec un écran de preuve de concept pour les régulateurs de YAP et TAZ, les effecteurs en aval critiques de la voie Hippo8,10,11. L’activité anormale de YAP et TAZ favorise plusieurs étapes de la cascade métastatique11 et est observée dans de nombreux cancers11,12,13. Cependant, la façon dont YAP et TAZ deviennent activés aberrantement dans certaines cellules cancéreuses n’est pas encore entièrement comprise. YAP et TAZ ne lient pas l’ADN, mais sont plutôt recrutés pour les promoteurs par d’autres facteurs de transcription. Les membres de la famille de facteurs de transcription du domaine TEA (TEAD) sont les principaux partenaires contraignants de YAP et de TAZ, et sont essentiels pour la plupart des fonctions dépendantes du YAP et de la TAZ. Notre construction reporter exprime luciferase luciole d’un promoteur YAP/TAZ-TEAD-sensible et des études précédentes ont démontré qu’il détecte fidèlement les changements dans YAP-TEAD et TAZ-TEAD activité transcriptionnelle2,14,15.
Notre approche est rapide, à débit moyen, et ne nécessite pas d’installations de dépistage, de robots automatisés ou de séquençage profond des bibliothèques mises en commun. Les coûts sont relativement bas et il y a de nombreuses bibliothèques disponibles dans le commerce à choisir. L’équipement et les réactifs requis sont également relativement standard dans la plupart des laboratoires. Il peut être utilisé pour dépister les régulateurs de pratiquement n’importe quel facteur de transcription si un journaliste basé sur la luciferase existe ou est généré. Nous utilisons cette approche pour dépister les shARN dans les cellules cancéreuses, mais toute lignée cellulaire qui peut être transfected avec une efficacité raisonnable pourrait être utilisé avec n’importe quel type de bibliothèque à réseau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Emily Norton et Mikaelan Cucciarre-Stuligross d’avoir participé à la préparation des vecteurs de shRNA. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention Susan G. Komen Career Catalyst qui a été décernée à J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
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