ऐरेगए पुस्तकालयों की मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और ड्यूल-लूसिफ़ेरेज़-आधारित रिपोर्टर का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर नियामकों की पहचान
Summary
प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए, हमने दोहरी-लुसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख का उपयोग करके सरणी लेंटिवायरल या रेट्रोवायरल आरएनएआई पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया। यह दृष्टिकोण एक ही प्रयोग में सैकड़ों उम्मीदवारों को स्क्रीन करने का एक त्वरित और अपेक्षाकृत सस्ता तरीका प्रदान करता है।
Abstract
ट्रांसक्रिप्शन कारक कई लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को बदल सकते हैं जो विभिन्न प्रकार की डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं जो उन्हें कैंसर विरोधी उपचारों के लिए अच्छे लक्ष्य बनाते हैं। हालांकि, सीधे ट्रांसक्रिप्शन कारकों को लक्षित करना अक्सर मुश्किल होता है और यदि एक या अधिक वयस्क ऊतकों में प्रतिलेखन कारक आवश्यक है तो प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा हो सकता है। अपस्ट्रीम नियामकों की पहचान करना जो कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को सक्रिय करते हैं, एक अधिक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है, खासकर यदि ये प्रोटीन दवा के लिए आसान हैं। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए सरणी मध्यम पैमाने पर लेंटिवायरल पुस्तकालयों और दोहरी-लूसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शनरिपोर्टर परख को संयोजित करने के लिए किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण एक ही प्रयोग में सैकड़ों जीन ों का परीक्षण करने का एक त्वरित, आसान और सस्ता तरीका प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक सरणी लेंटिवायरल आरएनएआई लाइब्रेरी की एक स्क्रीन का प्रदर्शन किया जिसमें यस-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) के कई नियामक और पीडीजेड-बाइंडिंग आकृति (TAZ), दो ट्रांसक्रिप्शनियल सह-सक्रियक हैं जो हिप्पो मार्ग के डाउनस्ट्रीम प्रभावक हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण को वस्तुतः किसी भी प्रतिलेखन कारक या सह-कारक के नियामकों के लिए स्क्रीन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और इसका उपयोग CRISPR/CAS9, cDNA, या ORF पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है ।
Introduction
इस परख का उद्देश्य वायरल पुस्तकालयों का उपयोग करने के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ती तरीके से प्रतिलेखन कारकों के नियामकों की पहचान है । एबररेंट ट्रांसक्रिप्शनगतिविधि कैंसर और मेटाटैसिस1,,2,,3,,4,,5,,6से जुड़ी है, इसलिए कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को लक्षित करना एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण है। हालांकि, प्रतिलेखन कारकों को अक्सर फार्माकोलॉजिकल रूप से7 को लक्षित करना मुश्किल होता है और वयस्क ऊतकों8,,9,,10में सामान्य सेलुलर कार्य के लिए कई की आवश्यकता होती है। कैंसर से जुड़े रास्तों को लक्षित करना जो रोग को चलाने के लिए प्रतिलेखन कारकों को सक्रिय करते हैं, कम गंभीर दुष्प्रभाव ों की क्षमता के साथ अधिक व्यवहार्य दृष्टिकोण है। सरणी लेंटिवायरल और रेट्रोवायरल आरएनएआई, CRISPR/CAS9, cDNA, या ORF पुस्तकालयों की वाणिज्यिक उपलब्धता शोधकर्ताओं को एक ही प्रयोग में कई जीन के महत्व का परीक्षण करने की अनुमति देता है । हालांकि, बदल प्रतिलेखन गतिविधि के लिए एक विश्वसनीय readout की आवश्यकता है ।
यहां, हम कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को विनियमित करने वाले प्रोटीन की पहचान करने के लिए दोहरी-लुसिफ़ेरेज़-आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख और सरणी लेंटिवायरल पुस्तकालयों के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस परख में, कैंसर से जुड़े जीन को लक्षित करने वाले shRNAs को मसूर के माध्यम से स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं को वितरित किया जाता है और कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके स्थिर एकीकरण के लिए चुना जाता है। कोशिकाओं को अगले एक रिपोर्टर निर्माण है कि अनुक्रिप्शन कारक है कि जांच की जा रही है और एक नियंत्रण निर्माण है कि एक संविलियन सक्रिय प्रमोटर है कि प्रतिलेखन कारक के लिए उत्तरदायी नहीं है की जांच की जा रही से रेनिला लूसिफ़ेरेज व्यक्त करने के लिए विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित जुगनू लूसिफ़ेरेज व्यक्त करता है के साथ ट्रांसफ्रेंस व्यक्त कर रहे हैं । हम YAP और TAZ के नियामकों के लिए एक सबूत की अवधारणा स्क्रीन के साथ इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन, हिप्पो मार्ग8,,10,,11के महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम प्रभावकों । वाईएपी और ताज़ की असामान्य गतिविधि मेटास्टैटिक झरना11 के कई चरणों को बढ़ावा देती है और कई कैंसर11,12,13में देखी जाती है ।13 हालांकि, कैसे YAP और TAZ कुछ कैंसर कोशिकाओं में aberrantly सक्रिय हो अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है । YAP और TAZ डीएनए बांध नहीं है, लेकिन इसके बजाय अंय प्रतिलेखन कारकों द्वारा प्रमोटरों के लिए भर्ती कर रहे हैं । टी डोमेन (टीईडी) प्रतिलेखन कारकों के परिवार के सदस्य वाईएपी और TAZ के लिए प्रमुख बाध्यकारी साझेदार हैं, और अधिकांश वाईएपी और TAZ-निर्भर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमारे रिपोर्टर ने वाईएपी/TAZ-TEAD-उत्तरदायी प्रमोटर से जुगनू लूसिफ़ेरेज़ व्यक्त किया है और पिछले अध्ययनों से यह दर्शाया है कि यह YAP-TEAD और TAZ-TEAD प्रतिलेखन गतिविधि2,,14,,15में परिवर्तन का ईमानदारी से पता लगाता है ।
हमारा दृष्टिकोण तेजी से, मध्यम थ्रूपुट है, और स्क्रीनिंग सुविधाओं, स्वचालित रोबोटों, या पूल किए गए पुस्तकालयों के गहरे अनुक्रमण की आवश्यकता नहीं है। लागत अपेक्षाकृत कम है और वहां कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालयों से चुनने के लिए कर रहे हैं । अधिकांश प्रयोगशालाओं में आवश्यक उपकरण और अभिकर्मक भी अपेक्षाकृत मानक हैं। यह वस्तुतः किसी भी प्रतिलेखन कारक के नियामकों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित रिपोर्टर मौजूद है या उत्पन्न होता है । हम कैंसर कोशिकाओं में shRNAs स्क्रीन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करें, लेकिन किसी भी सेल लाइन है कि उचित दक्षता से ट्रांससंक्रमित किया जा सकता है सरणी पुस्तकालय के किसी भी प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम एक दोहरी-ल्यूसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख के साथ संयोजन में सरणी वायरल पुस्तकालयों की मध्यम थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम श्रना वैक्टर की तैयारी में सहायता करने के लिए एमिली नॉर्टन और मिकाएलन Cucciarre-Stuligross का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एक सुसान जी कोमेन कैरियर उत्प्रेरक अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था जो जेएमएल (#CCR17477184) को सम्मानित किया गया था ।
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
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