Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase
Summary
Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.
Abstract
Fatores de transcrição podem alterar a expressão de numerosos genes-alvo que influenciam uma variedade de processos a jusante tornando-os bons alvos para terapias anticâncer. No entanto, direcionar diretamente os fatores de transcrição é muitas vezes difícil e pode causar efeitos colaterais adversos se o fator de transcrição for necessário em um ou mais tecidos adultos. Identificar reguladores a montante que ativam aberrrantamente fatores de transcrição em células cancerosas oferece uma alternativa mais viável, particularmente se essas proteínas são fáceis de drogar. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para combinar bibliotecas lentivirais de média escala e um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. Nossa abordagem oferece uma maneira rápida, fácil e barata de testar centenas de genes em um único experimento. Para demonstrar o uso desta abordagem, realizamos uma tela de uma biblioteca RNAi lentiviral organizada contendo vários reguladores de proteína associada a Sim (YAP) e co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ), dois co-ativadores transcritores que são os efeitos a jusante da via Hipopótamo. No entanto, essa abordagem pode ser modificada para os reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição ou co-fator e também pode ser usada para tela de bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.
Introduction
O objetivo deste ensaio é usar bibliotecas virais para identificar reguladores de fatores de transcrição de forma relativamente rápida e barata. A atividade transcricional aberrante está associada ao câncer e à metástase1,2,3,4,5,6, então direcionar fatores de transcrição em células cancerosas é uma abordagem terapêutica promissora. No entanto, fatores de transcrição são muitas vezes difíceis de atingir farmacologicamente7 e muitos são necessários para a função celular normal em tecidos adultos8,9,10. Direcionar as vias associadas ao câncer que ativam aberrrantamente fatores de transcrição para conduzir a doença é uma abordagem mais viável com potencial para ter efeitos colaterais menos graves. A disponibilidade comercial de bibliotecas RAi, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF, lentiona ou ré, permite aos pesquisadores testar a importância de inúmeros genes em um único experimento. No entanto, é necessária uma leitura confiável para a atividade transcricional alterada.
Aqui, descrevemos o uso de um ensaio transcricional baseado em duas luciferases e bibliotecas lentivirais organizadas para identificar proteínas que regulam fatores de transcrição em células cancerosas. Neste ensaio, as shRNAs que visam genes associados ao câncer são entregues às células cancerígenas de mamíferos através da transdução lentiviral e as células são selecionadas para integração estável usando puromicina. As células são transfeccionadas em seguida com uma construção de repórter que expressa a luciferase de vagalume impulsionada por um promotor específico para o fator de transcrição que está sendo investigado e um conjunto de controle que expressa a luciferase de Renilla de um promotor constitutivamente ativo que não responde ao fator de transcrição que está sendo investigado. Demonstramos essa abordagem com uma tela de prova de conceito para os reguladores da YAP e da TAZ, os efeitos críticos a jusante da via Hipopótamo88,10,,11. A atividade anormal de YAP e TAZ promove várias etapas da cascata metastática11 e é observada em muitos cânceres11,12,13. No entanto, como yap e TAZ se tornam aberrantemente ativados em algumas células cancerosas ainda não é totalmente compreendido. YAP e TAZ não ligam DNA, mas são recrutados para promotores por outros fatores de transcrição. Os membros da família tea domain (TEAD) de fatores de transcrição são os principais parceiros vinculantes para YAP e TAZ, e são críticos para a maioria das funções dependentes de YAP e TAZ. Nossa construção de repórter expressa a luciferase de vagalumes de um promotor yap/taz-TEAD-responsivo e estudos anteriores demonstraram que detecta fielmente alterações na atividade transcricional YAP-TEAD e TAZ-TEAD2,14,15.
Nossa abordagem é rápida, de médio porte, e não requer instalações de triagem, robôs automatizados ou sequenciamento profundo de bibliotecas agrupadas. Os custos são relativamente baixos e há inúmeras bibliotecas disponíveis comercialmente para escolher. Os equipamentos e reagentes necessários também são relativamente padrão na maioria dos laboratórios. Ele pode ser usado para rastrear reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição se um repórter baseado em luciferase existir ou for gerado. Usamos essa abordagem para tela shRNAs em células cancerosas, mas qualquer linha celular que possa ser transfeccionada com eficiência razoável poderia ser usada com qualquer tipo de biblioteca organizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, demonstramos uma abordagem para a triagem de média-duração de bibliotecas virais organizadas em combinação com um ensaio de repórter transcricional baseado em duas luciferases que pode ser usado para identificar e testar novos reguladores de fatores de transcrição. É fundamental caracterizar e otimizar o sistema de repórteres para cada linha celular antes de qualquer tela. Experimentos devem ser feitos para confirmar que o repórter está respondendo à atividade alterada do fator de transcrição…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ajudarna preparação de vetores shRNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Biologie du développement. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Recherche en cancérologie. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Recherche en cancérologie. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Recherche en cancérologie. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Recherche en cancérologie. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
