Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы
Summary
Для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов, мы разработали подход к экрану массивных лентивирных или ретровирусных рнки библиотек с помощью двойной люциферазы основе транскрипционного репортера ассс. Такой подход предлагает быстрый и относительно недорогой способ проверки сотен кандидатов в одном эксперименте.
Abstract
Транскрипционные факторы могут изменить экспрессию многочисленных генов-мишеней, которые влияют на различные процессы вниз по течению, что делает их хорошими мишенями для противораковой терапии. Однако, непосредственно ориентации транскрипционных факторов часто трудно и может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, если транскрипционный фактор необходим в одной или нескольких взрослых тканей. Выявление восходящих регуляторов, которые аберантно активируют транскрипционные факторы в раковых клетках, предлагает более осуществимую альтернативу, особенно если эти белки легко смягчены. Здесь мы описываем протокол, который может быть использован для объединения массивных среднесрочных лентивирных библиотек и двухлюциферазы основе транскрипционного репортера асссы для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Наш подход предлагает быстрый, простой и недорогой способ тестирования сотен генов в одном эксперименте. Чтобы продемонстрировать использование этого подхода, мы выполнили экран массивной лентивирусной библиотеки РНК, содержащей несколько регуляторов ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного со-активатора с pd’-связывающим мотивом (ТАЗ), двумя транскрипционными коактиваторами, которые являются эффекторами вниз по течению пути Гиппо. Однако этот подход можно было бы изменить для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции или со-фактора, а также можно было бы использовать для проверки библиотек CRISPR/CAS9, cDNA или ORF.
Introduction
Цель этого ассеса заключается в использовании вирусных библиотек для выявления регуляторов транскрипционных факторов относительно быстрым и недорогим способом. Аномальная транскрипционная активность связана с раком и метастазами1,,2,,3,,44,5,,6,поэтому таргетинг факторов транскрипции в раковых клетках является перспективным терапевтическим подходом. Тем не менее, транскрипционные факторы часто трудно ориентировать фармакологически7, и многие из них необходимы для нормальной клеточной функции во взрослых тканях88,9,,10. Ориентация на рак связанных путей, которые аберрантно активировать транскрипционные факторы для привода болезни является более осуществимым подходом с потенциалом иметь менее серьезные побочные эффекты. Коммерческая доступность массивных лентивирных и ретровирусных рнквирных РНК, CRISPR/CAS9, cDNA или ORF библиотек позволяет исследователям проверить важность многочисленных генов в одном эксперименте. Тем не менее, требуется надежное считывание для измененной транскрипционной активности.
Здесь мы описываем использование двойной люциферазы основе транскрипционного репортера анализ и массивные лентивирные библиотеки для выявления белков, которые регулируют транскрипционные факторы в раковых клетках. В этом исследовании, shRNAs, которые нацелены на рак связанных генов поставляются в клетки рака млекопитающих через лентивирусной трансдукции и клетки выбираются для стабильной интеграции с использованием пуромицина. Клетки следующий трансфицируется с репортером построить, что выражает светлячок luciferase управляется промоутер омрачается промоутер конкретных транскрипции фактор, который исследуется и контрольная конструкция, которая выражает Ренилья luciferase от constitutively активный промоутер, который не реагирует на транскрипции фактор исследуется. Мы демонстрируем этот подход с экраном доказательства концепции для регуляторов YAP и ТАЗ, критических эффекторов вниз по течению пути Гиппо8,10,11. Аномальная активность ЯП и ТАЗ способствует нескольким шагам метастатического каскада11 и наблюдается у многих видов рака11,,12,,13. Однако, как YAP и ТАЗ становятся аберантно активированы в некоторых раковых клетках еще не полностью понял. YAP и ТАЗ не связывают ДНК, но вместо этого набираются в промоутеров другими факторами транскрипции. Члены семейства факторов транскрипции TEA (TEAD) являются основными обязательными партнерами для YAP и ТАЗ, и имеют решающее значение для большинства функций, зависящих от YAP и ТАЗ. Наш репортер конструирует светлячок luciferase от YAP/ТАЗ-TEAD-реакционный промоутер и предыдущие изучения показали что оно верно обнаруживает изменения в YAP-TEAD и транскрипционной деятельности TA’-TEAD2,14,15.
Наш подход является быстрым, средней пропускной способностью и не требует скрининга, автоматизированных роботов или глубокого секвенирования объединенных библиотек. Затраты являются относительно низкими, и есть множество коммерчески доступных библиотек на выбор. Необходимое оборудование и реагенты также являются относительно стандартными в большинстве лабораторий. Он может быть использован для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции, если luciferase основе репортер существует или генерируется. Мы используем этот подход для скрининга shRNAs в раковых клетках, но любая клеточная линия, которая может быть трансфицирована с разумной эффективностью, может быть использована с любым типом массивной библиотеки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы демонстрируем подход к скринингу средней пропускной связи массивных вирусных библиотек в сочетании с анализом транскрипционного репортера на основе двойной люциферазы, который может быть использован для выявления и тестирования новых регуляторов транскрипци?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Эмили Нортон и Микаэлан Куччарре-Стулигсу за помощь в подготовке векторов шРНК. Эта работа была частично поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присуждается JML (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Biologie du développement. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Recherche en cancérologie. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Recherche en cancérologie. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Recherche en cancérologie. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Recherche en cancérologie. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
