Identifiering av transkriptionsfaktor regulatorer med hjälp av Medium-Genomströmning Screening av arrayed bibliotek och en Dual-Luciferase-Based Reporter
Summary
För att identifiera nya regulatorer av transkription faktorer, utvecklade vi en metod för skärmen arrayed lentiviral eller retroviral RNAi bibliotek med hjälp av en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett snabbt och relativt billigt sätt att skärmen hundratals kandidater i ett enda experiment.
Abstract
Transkriptionsfaktorer kan förändra uttrycket av många målgener som påverkar en mängd olika nedströmsprocesser som gör dem till bra mål för cancerbehandling. Emellertid, direkt inriktning transkription faktorer är ofta svårt och kan orsaka negativa biverkningar om transkriptionsfaktorn är nödvändig i en eller flera vuxna vävnader. Identifiera uppströms tillsynsmyndigheter som aberrantly aktivera transkriptionsfaktorer i cancerceller erbjuder ett mer genomförbart alternativ, särskilt om dessa proteiner är lätta att läkemedel. Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att kombinera arrayed medelstora lentivirala bibliotek och en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys för att identifiera nya regulatorer av transkription faktorer i cancerceller. Vårt tillvägagångssätt erbjuder ett snabbt, enkelt och billigt sätt att testa hundratals gener i ett enda experiment. För att demonstrera användningen av detta tillvägagångssätt utförde vi en skärm av en arrayed lentiviral RNAi bibliotek som innehåller flera regulatorer av Ja-associerade protein (YAP) och transkriptionella co-aktivator med PDZ-bindande motiv (TAZ), två transkriptionella co-aktivatorer som är nedströms effektfaktorer av Hippo utbildningsavsnitt. Detta tillvägagångssätt kan dock ändras för att kontrollera för tillsynsmyndigheter av praktiskt taget alla transkriptionsfaktor eller medfaktorer och kan också användas för att kontrollera CRISPR/CAS9-, cDNA- eller ORF-bibliotek.
Introduction
Syftet med denna analys är att använda virala bibliotek för att identifiera regulatorer av transkriptionsfaktorer på ett relativt snabbt och billigt sätt. Avvikande transkriptionell aktivitet är associerad med cancer och metastasering1,2,3,4,5,6, så inriktning transkription faktorer i cancerceller är en lovande terapeutisk metod. Transkriptionsfaktorer är dock ofta svåra att rikta farmakologiskt7 och många krävs för normal cellulär funktion i vuxna vävnader8,,9,10. Inriktning på cancer-associerade vägar som aberrantly aktivera transkription faktorer för att driva sjukdom är en mer genomförbar metod med potential att ha mindre allvarliga biverkningar. Den kommersiella tillgängligheten av arrayed lentiviral och retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, eller ORF bibliotek tillåter forskare att testa vikten av många gener i ett enda experiment. En tillförlitlig avläsning för ändrad transkriptionell aktivitet krävs dock.
Här beskriver vi användningen av en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys och arrayed lentiviral bibliotek för att identifiera proteiner som reglerar transkriptionsfaktorer i cancerceller. I denna analys, shRNAs som riktar cancer-associerade gener levereras till däggdjur cancerceller via lentiviral transduktion och celler väljs för stabil integration med puromycin. Cellerna är nästa transfected med en reporter konstruktion som uttrycker firefly luciferas drivs av en promotor som är specifik för transkriptionsfaktor som undersöks och en kontroll konstruktion som uttrycker Renilla luciferas från en constitutively aktiv promotor som inte är lyhörd för transkriptionsfaktorn undersöks. Vi visar detta tillvägagångssätt med en proof-of-concept skärm för regulatorer av YAP och TAZ, de kritiska nedströms effektfaktorer av Hippo väg8,10,11. Onormal aktivitet av YAP och TAZ främjar flera steg i ögonbevarande kaskad11 och observeras i många cancerformer11,12,13. Men hur YAP och TAZ blir aberrantly aktiveras i vissa cancerceller är ännu inte helt klarlagt. YAP och TAZ binder inte DNA, utan rekryteras istället till initiativtagare av andra transkriptionsfaktorer. Medlemmar i TEA-domänens (TEAD) familj av transkriptionsfaktorer är de viktigaste bindande partnerna för YAP och TAZ, och är avgörande för de flesta YAP- och TAZ-beroende funktioner. Vår reporter konstruktion uttrycker firefly luciferas från en YAP /TAZ-TEAD-lyhörd promotor och tidigare studier har visat att det troget upptäcker förändringar i YAP-TEAD och TAZ-TEAD transkriptionell aktivitet2,14,15.
Vårt tillvägagångssätt är snabb, medelgenomströmning, och kräver inte screening anläggningar, automatiserade robotar, eller djup sekvensering av poolade bibliotek. Kostnaderna är relativt låga och det finns många kommersiellt tillgängliga bibliotek att välja mellan. Den utrustning och de reagenser som krävs är också relativt standard i de flesta laboratorier. Det kan användas för att skärmen för regulatorer av praktiskt taget alla transkriptionsfaktor om en luciferas-baserad reporter finns eller genereras. Vi använder denna metod för att skärmen shRNAs i cancerceller, men alla cellinje som kan transfected med rimlig effektivitet kan användas med någon typ av arrayed bibliotek.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie visar vi en metod för medium-genomströmning screening av arrayed viral bibliotek i kombination med en dual-luciferase-baserade transkriptionella reporter analys som kan användas för att identifiera och testa nya regulatorer av transkription faktorer. Det är viktigt att karakterisera och optimera reportersystemet för varje cellinje före en skärm. Experiment bör göras för att bekräfta att reportern är lyhörd för förändrad aktivitet av transkriptionsfaktorn som undersöks och omfattningen av …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Emily Norton och Mikaelan Cucciarre-Stuligross för att de hjälper till vid beredningen av shRNA-vektorer. Detta arbete stöddes delvis av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tilldelas J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Biologie du développement. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Recherche en cancérologie. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Recherche en cancérologie. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Recherche en cancérologie. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Recherche en cancérologie. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
