Monstervoorbereiding in kwartskristal microbalans metingen van eiwit adsorptie en polymeer mechanica

Summary

De Quartz Crystal micro Balance kan nauwkeurige massa-en viscoelastische eigenschappen bieden voor films in het micron-of submicron bereik, wat relevant is voor onderzoeken in biomedische en milieu-sensing, coatings en polymeer wetenschappen. De monster dikte beïnvloedt welke informatie kan worden verkregen uit het materiaal dat in aanraking komt met de sensor.

Abstract

In deze studie presenteren we verschillende voorbeelden van hoe dunne film voorbereiding voor kwartskristal microbalans experimenten de juiste modellering van de gegevens informeert en bepaalt welke eigenschappen van de film kunnen worden gekwantificeerd. De Quartz Crystal micro Balance biedt een uniek gevoelig platform voor het meten van fijne veranderingen in de massa en/of mechanische eigenschappen van een toegepaste film door het observeren van de veranderingen in mechanische resonantie van een kwartskristal oscillerend bij hoge frequentie. De voordelen van deze aanpak zijn de experimentele veelzijdigheid, het vermogen om veranderingen in eigenschappen te bestuderen over een breed scala aan experimentele tijds lengtes en het gebruik van kleine steekproefgroottes. We laten zien dat we, op basis van de dikte en shear modulus van de laag die op de sensor is afgezet, verschillende informatie uit het materiaal kunnen verkrijgen. Hier wordt dit concept specifiek benut om experimentele parameters weer te geven, resulterend in massa-en viscoelastische berekeningen van geadsorlakte collageen op goud en poly elektrolyten complexen tijdens zwelling als functie van zoutconcentratie.

Introduction

De Quartz Crystal micro Balance (QCM) maakt gebruik van het piëzo-elektrische effect van een kwartskristal om de resonante frequentie te bewaken, die afhankelijk is van de massa die aan het oppervlak wordt gehecht. De techniek vergelijkt de resonante frequentie en bandbreedte van een AT cut Quartz Crystal sensor (meestal in het bereik van 5 MHz)¹ in lucht of een vloeistof naar de frequentie en bandbreedte van de sensor na de afzetting van een film. Er zijn verschillende voordelen voor het gebruik van de QCM te bestuderen van dunne film eigenschappen en interfaces, met inbegrip van de hoge gevoeligheid voor massa en potentieel aan viscoelastische eigenschaps wijzigingen (afhankelijk van de monster uniformiteit en dikte), de mogelijkheid om studies uit te voeren in situ², en de mogelijkheid om te sonde een veel kortere Rheologische tijdschaal dan traditionele shear reologie of dynamische mechanische analyse Het terugdringen van een korte Rheologische tijdschaal maakt het mogelijk om te observeren hoe de respons op deze tijdschaal zowel over extreem korte (MS)³ als over lange (jaren) duur⁴verandert. Deze mogelijkheid is gunstig voor de studie van een verscheidenheid aan kinetische processen en is ook een nuttige uitbreiding van de traditionele rheometrische technieken^5,6.

De hoge gevoeligheid van de QCM heeft ook geleid tot een intensief gebruik in biologische toepassingen die de fundamentele interacties van extreem kleine biomoleules bestuderen. Een ongecoat of gefunctionaliseerd sensoroppervlak kan worden gebruikt om de eiwit adsorptie te onderzoeken; nog verder kan biosensing door complexe bindings gebeurtenissen tussen enzymen, antilichamen en aptamers worden onderzocht op basis van veranderingen in massa^7,8,9. De techniek is bijvoorbeeld gebruikt om de transformatie van blaasjes naar een vlakke lipide dubbellaag te begrijpen als een tweefasig proces van adsorptie van vloeistof-bevattende blaasjes naar een stijve structuur door het observeren van correlerende veranderingen in frequentie en visco-elasticiteit¹⁰. De afgelopen jaren heeft de QCM bovendien een robuust platform aangeboden om de levering van geneesmiddelen door blaasjes of nanodeeltjes¹¹te controleren. Op de kruising van Materials Engineering en moleculaire en cellulaire biologie, kunnen we de QCM gebruiken om de belangrijkste interacties tussen materialen en bioactieve componenten zoals eiwitten, nucleïnezuren, liposomen en cellen te verhelmaken. Bijvoorbeeld, eiwit adsorptie aan een biomateriaal bemiddelt downstream cellulaire reacties zoals ontsteking en wordt vaak gebruikt als een positieve indicator van biocompatibiliteit, terwijl in andere gevallen extracellulaire eiwit gehechtheid aan coatings die interface met bloed kunnen induceren gevaarlijke stolling in vaartuigen^12,13. De QCM kan daarom worden gebruikt als een tool om kandidaten optimaal te selecteren voor verschillende behoeften.

Twee gemeenschappelijke benaderingen voor het uitvoeren van QCM-experimenten verzamelen analoge gegevens uit het experiment: de eerste benadering registreert de frequentieverschuiving en de halve bandbreedte (Γ) van de geleidings piek. De tweede benadering, QCM met dissipatie (QCM-D), registreert de frequentieverschuiving en de dissipatiefactor, die direct evenredig is met Γ door vergelijking 1,¹⁴

1

waarbij D de dissipatiefactor is en ƒ de frequentie. Zowel D als Γ zijn gerelateerd aan het dempings effect dat de film op de sensor heeft, wat een indicatie geeft van de stijfheid van de film. Het subscript n duidt de frequentie-Overtoon of harmonische aan, die de oneven resonerende frequenties van de kwarts sensor zijn (n = 1, 3, 5, 7…). Verdere bespreking van modellen met behulp van meerdere harmonischen om de massa en visco-elastische eigenschappen van een film te verkrijgen, kan worden gevonden in een review door johannsmann¹⁴ en eerdere papers uit de Shull-groep^15,16,17,18.

Een belangrijke overweging voor het voorbereiden van QCM-samples is het toepassen van de dunne film op het sensoroppervlak. Enkele veelgebruikte methoden zijn spin coating, dip coating, druppel coating of adsorptie van de film op het sensoroppervlak tijdens het experiment^19,20. Er zijn vier regio’s voor QCM-samples: de Sauerbrey-limiet, het visco-elastische regime, het bulk regime en het overbevochte regime. Voor voldoende dunne folies geldt de Sauerbrey-limiet, waarbij de frequentieverschuiving (Δƒ) de oppervlakte massa van de film vormt. Binnen de Sauerbrey-limiet schaalt de frequentieverschuiving lineair met de resonante harmonische, n, en veranderingen in de dempingsfactor (D of Γ) zijn over het algemeen klein. In dit regime is onvoldoende informatie beschikbaar om de Rheologische eigenschappen van de laag op unieke wijze te bepalen zonder bijkomende veronderstellingen te maken. Gegevens in dit regime worden gebruikt voor het berekenen van de oppervlakte massa (of dikte als de dichtheid a prioribekend is) van de film. In het bulk regime waar het medium dat in aanraking komt met het kristal voldoende dik is, wordt de afschuiving Golf doorgegeven in het medium voordat het volledig wordt bevochtigd. Hier kan geen massa-informatie worden verkregen met behulp van Δƒ. Echter, in deze regio, de visco-elastische eigenschappen worden betrouwbaar bepaald met behulp van de combinatie van Δƒ en δγ ^15,18. In het bulk regime, als het medium te stijf is, zal de film de resonantie van de sensor uitdamp, waardoor het verzamelen van betrouwbare gegevens uit de QCM wordt voorkomen. Het visco-elastische regime is het tussenliggende regime waarbij de film dun genoeg is om de afschuif Golf volledig door de film te laten propageren en betrouwbare waarden te hebben voor de dempingsfactor. De dempingsfactor en Δƒ kunnen vervolgens worden gebruikt om de visco-elastische eigenschappen van de film te bepalen, evenals de massa ervan. Hier worden de visco-elastische eigenschappen gegeven door het product van de dichtheid en de grootte van de complexe shear modulus | G* | p en de fasehoek gegeven door Φ = arctan (g “ / g ‘). Wanneer films worden bereid in de Sauerbrey-limiet, kan de massa per eenheids gebied direct worden berekend op basis van de Sauerbrey-vergelijking die onder²¹wordt weergegeven,

2

waar Δƒ_n is de verandering in de resonante frequentie, n is de Overtoon van belang, ƒ₁ is de resonante frequentie van de sensor, Δm / A is de massa per gebied van de film, en Z_q is de akoestische impedantie van kwarts, die voor bij cut Quartz Z_q = 8,84 x 10⁶kg / m²s. Het viscoelastische regime is het meest geschikt voor de studie van polymeer films, en de bulk limiet is nuttig voor het bestuderen van viskeuze polymeer²² of eiwit oplossingen¹⁶. De verschillende regimes zijn afhankelijk van de eigenschappen van het materiaal van belang, met de optimale dikte voor volledige visco-elastisch en massa karakterisering in het algemeen toenemen met de film stijfheid. Figuur 1 beschrijft de vier regio’s met betrekking tot de gebieddichtheid van de film, complexe shear modulus en fasehoek, waar we een specifieke relatie hebben aangenomen tussen de fasehoek en de film stijfheid waarvan is aangetoond dat ze relevant zijn voor materialen van dit type. Veel films van praktisch belang zijn te dik voor het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen met QCM, zoals bepaalde biofilms, waar de diktes zijn op de orde van de tientallen tot honderden micron²³. Dergelijke dikke films zijn over het algemeen niet geschikt om te studeren met behulp van de QCM, maar kunnen worden gemeten met veel lagere frequentie resonatoren (zoals torsie resonatoren)²³, waardoor de afschuif Golf verder in de film voortspruit.

Om te bepalen welk regime relevant is voor een bepaald QCM-monster, is het belangrijk om de parameter d /λ_n te begrijpen, wat de verhouding is tussen de laagdikte (d) en de afschuif golflengte van de mechanische oscillatie van de kwarts kristallen sensor (λ_n)^15,16,18. Het ideale viscoelastische regime is d /λ_n = 0,05-0,2¹⁸, waarbij de waarden onder 0,05 binnen de Sauerbrey-limiet liggen en de waarden boven 0,2 de bulk regeling benaderen. Een striktere beschrijving van d /λ_n is elders^15,18, maar het is een kwantitatieve parameter die de Sauerbrey-limiet en de viscoelastische grens afbakenen. De hieronder gebruikte analyseprogramma’s bieden deze parameter rechtstreeks.

Er zijn enkele extra beperkingen voor het analyseren van dunne films met de QCM. De Sauerbrey en viscoelastische berekeningen veronderstellen dat de film homogeen is, zowel in de hele filmdikte als lateraal over het elektrode oppervlak van de QCM. Hoewel deze veronderstelling het uitdagend maakt om films te bestuderen die holtes of vulstoffen aanwezig zijn, zijn er enkele QCM-onderzoeken uitgevoerd naar films bestaande uit geënt nanodeeltjes⁶. Als de heterogeneities klein zijn in vergelijking met de totale filmdikte, kunnen er nog steeds betrouwbare viscoselastische eigenschappen van het samengestelde systeem worden verkregen. Voor meer heterogene systemen moeten waarden die zijn verkregen uit een viscoelastische analyse altijd met grote voorzichtigheid worden bekeken. Idealiter moeten de resultaten van systemen met een onbekende heterogeniteit worden gevalideerd tegen systemen waarvan bekend is dat ze homogeen zijn. Dat is de aanpak die we hebben ingenomen in het voorbeeld systeem dat in dit document wordt beschreven.

Een belangrijk punt dat we illustreren in dit artikel is de exacte correspondentie tussen QCM-metingen gedaan in het frequentiedomein (waar Γ wordt gerapporteerd) en de tijddomein experimenten (waarbij D wordt gerapporteerd). De resultaten van twee verschillende QCM-experimenten, één tijddomein en één frequentiedomein worden beschreven, elk met een verschillend maar conceptueel verwant modelsysteem. Het eerste systeem is een eenvoudig voorbeeld van collageen gehechtheid aan de sensor ter illustratie van representatieve bindende kinetiek en equilibratie van adsorptie in de loop van de tijd gedurende een tijdsdomein (QCM-D) meting. Collageen is het meest overvloedige eiwit in het lichaam, bekend om zijn veelzijdigheid van bindend gedrag en morfologie. De hier gebruikte collageen oplossing vereist geen extra functionalisatie van het goud oppervlak van de sensor om adsorptie⁹te induceren. Het tweede experimentele systeem is een polyelektrolyt complex (PEC) bestaande uit anionisch polystyreen sulfonaat (PSS) en kationisch poly (diallyldimethylammonium) (PDADMA), bereid op dezelfde manier als Sadman et al.²². Deze materialen zwellen en worden zacht in zout (KBr in dit geval) oplossingen, het aanbieden van een eenvoudig platform voor het bestuderen van polymeer mechanica met behulp van een frequentiedomein benadering (QCM-Z). Voor elk protocol wordt het proces van het voorbereiden, nemen en analyseren van een meting weergegeven in Figuur 2. Het schematische beeld geeft aan dat het belangrijkste verschil tussen de QCM-Z-en QCM-D-benaderingen zich bevindt in de stap voor het verzamelen van gegevens en de instrumentatie die in het experiment wordt gebruikt. Alle genoemde monster voorbereidings technieken zijn compatibel met beide benaderingen, en elke benadering kan monsters analyseren in de drie regio’s afgebeeld in Figuur 1.

Onze gegevens tonen aan dat de voorbereiding van monsters, hetzij door sensor coating vóór of tijdens een meting, dicleert de mogelijkheid om de viscoelastische eigenschappen van een systeem te extraheren. Door het ontwerpen van de vroege stadia van een experiment op de juiste manier, kunnen we bepalen welke informatie we nauwkeurig kunnen verzamelen tijdens de analyse stap.

Protocol

QCM-D collageen adsorptie 1. monstervoorbereiding en voor reiniging van de sensor Bereid 20 mL van 0,1 M acetaatbuffer, aanpassing van de pH met HCl en NaOH indien nodig om pH = 5,6. Voeg rat tail collageen oplossing toe aan de 20 mL acetaatbuffer onder steriele omstandigheden tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Reinig de goudgecoate kwarts sensor om organisch en biologisch materiaal te verwijderen25,</su…

Representative Results

De veranderingen in frequentie met de tijd tijdens de eiwit adsorptie vertonen een karakteristieke kromme en plateau weergegeven in Figuur 3a-B. De initiële buffer Wash van 1x PBS over het blote sensoroppervlak induceert slechts verwaarloosbare veranderingen in frequentie, en biedt een stabiele basislijn om te fungeren als referentie voor toekomstige gegevenspunten. De introductie van collageen oplossing veroorzaakt eiwit adsorptie om te beginnen, waargenomen als een gestag…

Discussion

De adsorptie resultaten van collageen omvatten de Sauerbrey-en viscoelastische regimes. Door het uitzetten van de frequentie verschuivingen genormaliseerd naar het corresponderende harmonische getal, zien we dat de Sauerbrey limiet geldt voor ongeveer de eerste 2 h van de meting. Met toenemende massa aan de sensor, echter, de genormaliseerde frequentie verschuivingen voor de derde en vijfde harmonischen beginnen af te wijken van elkaar (t > 2 h), wat duidt op een vermogen om te bepalen van de viscoelastische eig…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling