הכנה לדוגמא במיקרומאזן קריסטל קוורץ מדידות של חלבון ומכניקה פולימר

Summary

המיקרו-איזון בגביש הקוורץ יכול לספק מגוון מדויק וגמיש לסרטים בטווח מיקרון או סאב-מיקרון, הרלוונטי לחקירות בעלי חישה והסביבה, ציפויים ומדעי הפולימר. עובי המדגם משפיע על המידע שניתן להשיג מהחומר במגע עם החיישן.

Abstract

במחקר זה, אנו מציגים דוגמאות שונות של כמה דק הכנת הסרט לניסויים במיקרואיזון קריסטל קוורץ המודיעה על המידול המתאים של הנתונים וקובעת אילו מאפיינים של הסרט ניתן לכמת. המיקרו-מאזן גביש הקוורץ מציע פלטפורמה רגישה במיוחד למדידת שינויים עדינים בתכונות מסה ו/או מכניות של סרט שהוחל על-ידי התבוננות בשינויים בתהודה מכנית של גביש קוורץ בתדר גבוה. היתרונות של גישה זו כוללים את הרב-תכליתיות הניסיונית שלה, יכולת ללמוד שינויים בנכסים במגוון רחב של אורכי זמן ניסיוניים ושימוש במידות מדגם קטנות. אנו מדגימים כי, בהתבסס על עובי ולהטות את מודול השכבה שהופקדו על החיישן, אנו יכולים להשיג מידע שונה מן החומר. כאן, קונספט זה מנוצל במיוחד כדי להציג פרמטרים ניסיוניים וכתוצאה מכך חישובי המסה והגמיש של קולגן נספחת על מכלולי זהב ופוליאלקטרוליט במהלך נפיחות כפונקציה של ריכוז מלח.

Introduction

מאזן המיקרואיזון הגבישי של גביש הקוורץ (QCM) ממנף את האפקט הפיזואלקטרי של גביש קוורץ כדי לנטר את תדר התהודה שלו, התלוי בנפח המסה שעל פני השטח. הטכניקה משווה את התדר התהודה ואת רוחב הפס של חיישן AT גזור גביש קוורץ (בדרך כלל בטווח של 5 MHz)¹ באוויר או נוזל לתדר רוחב פס של החיישן לאחר התצהיר של סרט. ישנם מספר יתרונות עבור שימוש QCM לחקר מאפייני הסרט דק וממשקים, כולל רגישות גבוהה למסה ופוטנציאלי שינויים אלסטי המאפיין (בהתאם אחידות לדוגמה עובי), את היכולת לבצע מחקרים באתרו², ואת היכולת לחקור ציר זמן הרבה יותר קצר מאשר להטות מסורתי הטיה או ניתוח מכני דינאמי (DMA) בדיקת ציר זמן קצר לאחר מאפשרת התבוננות באופן שבו התגובה בציר הזמן הזה משתנה במהלך קצר מאוד (אלפיות)³ וארוך (שנים) משכי זמן⁴. יכולת זו מועילה לחקר מגוון תהליכים קינטית והיא גם הרחבה שימושית של טכניקות מסורתיות מסוג rheometric^5,6.

הרגישות הגבוהה של QCM הובילה גם את השימוש הכבד שלה ביישומים ביולוגיים לחקור את האינטראקציות הבסיסיות של biomolecules קטן מאוד. ניתן להשתמש במשטח חיישנים בלתי מצופה או פונקציונליזציה כדי לחקור ספיחה של חלבונים; עוד יותר, ביוחישה באמצעות אירועי קשירה מורכבים בין אנזימים, נוגדנים ואפתמים ניתן לבחון על פי שינויים במסה^7,8,9. למשל, הטכניקה שימש כדי להבין את הטרנספורמציה של ושלפוחיות לשומנים מישורי bilayer כתהליך דו-שלבי של ספיחה של נוזלים המכילים שלפוחיות למבנה נוקשה על ידי התבוננות בשינויים הקשורים בתדירות ובגמישות אלסטיות¹⁰. בשנים האחרונות, QCM הציע בנוסף פלטפורמה חזקה כדי לפקח על אספקת סמים על ידי שלפוחיות או חלקיקים¹¹. בהצטלבות של הנדסת חומרים וביולוגיה מולקולרית ותאית, אנו יכולים להשתמש ב-QCM כדי להבהיר אינטראקציות מפתח בין חומרים ורכיבים ביו-אקטיביים כגון חלבונים, חומצות גרעין, ליפוזומים ותאים. לדוגמה, ספיחה חלבון כדי ביומטריה במורד התגובות הסלולר כגון דלקת משמש לעתים קרובות כאינדיקטור חיובי של biocompatibility, ואילו במקרים אחרים מצורף חלבון לציפוי ממשק עם דם יכול לגרום קרישה מסוכן בכלי^12,13. לפיכך, ניתן להשתמש ב-QCM ככלי לבחירת מועמדים אופטימליים לצרכים שונים.

שתי גישות משותפות לביצוע ניסויים ב-QCM אוספות נתונים מקובלים מהניסוי: הגישה הראשונה מתעדת את משמרת התדר ואת רוחב הפס החצי (Γ) של הפסגה החשמלית. הגישה השנייה, QCM עם פליטת (QCM-D), מתעדת את משמרת התדר ואת פקטור הפיזור, אשר פרופורציונלי ישירות Γ דרך המשוואה 1,¹⁴

1

כאשר D הוא גורם הפיזור ו מואייסיב הוא התדר. הן D ו Γ קשורים אפקט השיכוך הסרט יש על החיישן, אשר נותן אינדיקציה לנוקשות של הסרט. הכתב התחתי n מציין את התדר או הרמוני, שהם תדרי התהודה המוזרים של חיישן הקוורץ (n = 1, 3, 5, 7…). לדיון נוסף במודלים המשתמשים בהרמוניה מרובה, ניתן למצוא את המסה והתכונות האלסטיים של הסרט בסקירה של יוחנן בן¹⁴ ומסמכים קודמים מקבוצת שובל^15,16,17,18.

שיקול מפתח אחד להכנת דגימות QCM הוא כיצד להחיל את הסרט הדק על משטח החיישן. כמה שיטות נפוצות כוללות ציפוי ספין, ציפוי מטבל, ציפוי ירידה, או ספיחה של הסרט על פני החיישן במהלך הניסוי^19,20. ישנם ארבעה אזורים לדגימות QCM: מגבלת Sauerbrey, משטר הגמיש, המשטר הצובר והמשטר העילי. עבור סרטים דקים מספיק, מגבלת Sauerbrey חל, כאשר התדירות משמרת (Δמואייסיב) מספק את הצפיפות המסה של פני השטח של הסרט. בתוך מגבלת Sauerbrey, תדירות משמרת המאזניים ליניארי עם הרמוני התהודה, n, ושינויים מקדם השיכוך (D או Γ) הם בדרך כלל קטנים. במשטר זה לא ניתן למצוא מידע מספיק כדי לקבוע באופן ייחודי את המאפיינים הרטילוגיים של השכבה מבלי לקבל הנחות נוספות. נתונים במשטר זה משמשים כדי לחשב את הצפיפות המסה של פני השטח (או עובי אם הצפיפות ידועה הפריורי) של הסרט. במשטר הצובר, שבו המדיום במגע עם הגביש הוא עבה מספיק, גל האוונזאת מפיץ את הגל לתוך המדיום לפני שהוא מוכנס לגמרי. כאן, לא ניתן להשיג מידע המוני באמצעות Δמואייסיב. עם זאת, באזור זה, מאפיינים גמישים הגמיש נקבעים באופן אמין באמצעות שילוב של Δמואייסיב ו ΔΓ ^15,18. במשטר בצובר, אם המדיום הוא נוקשה מדי, הסרט להלח את התהודה של החיישן, מונע את האוסף של כל הנתונים האמינים מ QCM. המשטר הגמיש והנידק הוא המשטר המתווך שבו הסרט הוא רזה מספיק כדי לקבל את גל ההטיה במלואו דרך הסרט, כמו גם ערכים אמינים עבור הגורם החשמלי. מקדם השיכוך ו Δמואייסיב ניתן להשתמש כדי לקבוע את המאפיינים אלסטי וגמיש של הסרט, כמו גם המסה שלה. כאן, מאפיינים גמישים וגמיש מקבלים על ידי תוצר של הצפיפות ואת הגודל של מודול ההטיה המורכבת | G* | p ואת השלב זווית שניתנו על ידי Φ = arctan (g “ / g“). כאשר הסרטים מוכנים במגבלת Sauerbrey, ניתן לחשב את האזור מסה לכל יחידה בהתבסס על משוואת Sauerbrey המוצגת מתחת ל^-21,

2

כאשר Δמואייסיב_n הוא השינוי בתדר התהודה, n הוא הטון של עניין, מואייסיב₁ הוא תדירות התהודה של החיישן, Δm / A הוא המסה לאזור של הסרט, ו- Z_q הוא עכבה אקוסטית של קוורץ, אשר בשנת לחתוך קוורץ הוא Z_q = 8.84 x 10⁶ק ג / m²s. המשטר הגמיש והגמישה מתאים ביותר לחקר הסרטים הפולימריים, ומגבלת הכמויות היא שימושית ללימוד פולימר בנפח²² או פתרונות חלבון¹⁶. המשטרים השונים תלויים בתכונות של חומר העניין, עם העובי האופטימלי באופן מיטבי, ובדרך כלל הולך וגובר עם קשיות הסרט. איור 1 מתאר את ארבעת האזורים ביחס לצפיפות אריאל של הסרט, מודול הטיה מורכבים, וזווית הפאזה, שם הנחנו מערכת יחסים ספציפית בין זווית השלב ואת קשיות הסרט כי הוכח להיות רלוונטי לחומרים מסוג זה. סרטים רבים של התעניינות מעשית עבים מדי ללימוד התכונות האלסטיים של הגמיש עם QCM, כגון ביואמים מסוימים, שבהם העוביים מסודרים על פי הסדר של עשרות עד מאות מיקרון²³. סרטים עבים כאלה הם בדרך כלל לא מתאימים ללמוד באמצעות QCM, אבל ניתן למדוד באמצעות מהדהד בתדר נמוך יותר (כגון המאיירים)²³, המאפשר גל להטות להפיץ עוד לתוך הסרט.

כדי לקבוע איזה משטר רלוונטי למדגם qcm נתון, חשוב להבין את הפרמטר d /λ_n , שהוא היחס של עובי הסרט (ד) כדי להטות את אורך הגל של תנודה מכנית של חיישן גביש קוורץ (λ_n)^15,16,18. המשטר האידיאלי האלסטי גמיש הוא d /λ_n = 0.05-0.2¹⁸, שבו ערכים מתחת 0.05 נמצאים בתוך המגבלה Sauerbrey וערכים לעיל 0.2 גישה למשטר בצובר. תיאור קפדני יותר של d /λ_n מסופק במקום אחר^15,18, אבל זה פרמטר כמותי להתוות את המגבלה Sauerbrey ואת המגבלה אלסטי הגמיש. תוכניות הניתוח המשמשות להלן מספקות פרמטר זה ישירות.

יש כמה מגבלות נוספות לניתוח סרטים דקים עם QCM. Sauerbrey והחישובים אלסטי וגמיש להניח את הסרט הוא הומוגנית הן ברחבי עובי הסרט ולרוחב על פני השטח אלקטרודה של QCM. בעוד הנחה זו עושה את זה מאתגר ללמוד סרטים שיש להם חללים או מילוי נוכח, היו כמה חקירות QCM לסרטים המורכב של חלקיקים מושתל⁶. אם ההטרוסקסואלים קטנים בהשוואה לעובי הסרט הכולל, ניתן להשיג באופן אמין מאפיינים אלסטיים של המערכת המורכבת. למערכות הטרוגניות נוספות, יש לצפות בערכים המתקבלים מניתוח גמיש ובזהירות רבה. באופן אידיאלי, התוצאות שהתקבלו ממערכות עם טרוגניות לא ידוע צריך להיות מאומת נגד מערכות אשר ידועים להיות הומוגנית. זוהי הגישה שאנו לקחנו במערכת הדוגמה המתוארת במאמר זה.

נקודה חשובה שאנו ממחישים במאמר זה היא התכתובת המדויקת בין מדידות QCM שנעשו בתחום התדרים (כאשר Γ מדווח) והניסויים בתחום הזמן (כאשר D מדווחים). תוצאות משני ניסויים QCM שונים, תחום אחד בזמן ותחום תדר אחד, מתוארים, כל אחד מעורב שונה אך מושגית מערכת הקשורים מודל. המערכת הראשונה היא דוגמה פשוטה של קולגן המצורף לחיישן כדי להמחיש את הקינטיקה כריכה הנציגה ואת השפה של ספיחה לאורך זמן במהלך תחום הזמן (qcm-D) מדידה. קולגן הוא החלבון הנפוץ ביותר בגוף, ידוע צדדיות שלה של התנהגויות קשירה מורפולוגיה. פתרון הקולגן המשמש כאן אינו דורש פונקציונליות נוספת של משטח הזהב של החיישן כדי לגרום ספיחה⁹. המערכת הניסיונית השנייה היא קומפלקס פוליאלקטרוליט (מורכב מקלקר) המורכב מפוליסטירן מוקצף (PSS) ומפולי (דיאלאילדימונומוניום) (PDADMA) שהוכנו באותה צורה כמו Sadman ואח ‘²². חומרים אלה להתנפח ולהיות רך מלח (KBr במקרה זה) פתרונות, המציעה פלטפורמה פשוטה ללימוד מכניקה פולימר באמצעות גישה תחום תדר (QCM-Z). עבור כל פרוטוקול, תהליך ההכנה, הנקיטת והניתוח של מדידה מוצג באיור 2. הסכמטי מראה כי ההבדל העיקרי בין הגישות QCM-Z ו-QCM-D הוא בשלב איסוף הנתונים והמכשור המשמש בניסוי. כל טכניקות ההכנה לדוגמה המוזכרות תואמות לשתי הגישות, וכל גישה יכולה לנתח דגימות בשלושת האזורים המתוארים באיור 1.

הנתונים שלנו מדגימים כי הכנת דגימות, בין אם על ידי ציפוי חיישן לפני או במהלך מדידה, מכתיב את היכולת לחלץ את התכונות האלסטי הגמיש של מערכת. על ידי עיצוב השלבים המוקדמים של הניסוי כראוי, אנו יכולים לקבוע איזה מידע אנחנו יכולים לאסוף במדויק במהלך שלב הניתוח.

Protocol

QCM-D קולגן וספיחה 1. הכנה לדוגמא וסנסור טרום ניקוי הכינו 20 מ ל של 0.1 מאגר אצטט M, התאמת ה-pH עם HCl ו NaOH לפי הצורך כדי להשיג pH = 5.6. הוסף העכבר זנב החולדה פתרון ל 20 מ ל של מאגר אצטט תחת תנאים סטריליים לריכוז הסופי של 10 μg/mL. נקו את חיישן הקוורץ המצופה בזהב להסרת ח?…

Representative Results

השינויים בתדר עם הזמן במהלך התצוגה ספיחה חלבון מאפיין עקומת הרמה המוצגת באיור 3א-ב. שטיפת המאגר הראשונית של 1x PBS על פני שטח החיישן החשוף משרה רק שינויים זניחים בתדר, המציע קו בסיס קבוע כדי לשמש כהפניה לנקודות נתונים עתידיים. המבוא של פתרון קולגן גורם ספיחה חלבון להת…

Discussion

תוצאות הקולגן מSauerbrey ומשטרי הגמיש. על ידי התוויית התדר משתנה מנורמל למספר ההרמוני המתאים, אנו מתבוננים כי המגבלה Sauerbrey מחזיקה נכון עבור כ 2 ה הראשון של המדידה. עם זאת, עם המסה גוברת הקפדה על החיישן, עם זאת, תדירות מנורמלת עבור הרמוני השלישי והחמישי להתחיל לסטות אחד מהשני (t > 2 h), המציין את ?…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling