प्रोटीन एसोर्टपशन और पॉलिमर मैकेनिक्स के क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस मापन में नमूना तैयारी

Summary

क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस माइक्रोन या सबमाइक्रोन रेंज में फिल्मों के लिए सटीक द्रव्यमान और चिपचिपा गुण प्रदान कर सकता है, जो बायोमेडिकल और पर्यावरण संवेदन, कोटिंग्स और बहुलक विज्ञान में जांच के लिए प्रासंगिक है। नमूना मोटाई प्रभावित करता है जो जानकारी सेंसर के संपर्क में सामग्री से प्राप्त की जा सकती है।

Abstract

इस अध्ययन में, हम विभिन्न उदाहरण प्रस्तुत करते हैं कि क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस प्रयोगों के लिए पतली फिल्म तैयारी डेटा के उपयुक्त मॉडलिंग को कैसे सूचित करती है और यह निर्धारित करती है कि फिल्म के किन गुणों की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस उच्च आवृत्ति पर एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल दोलन की यांत्रिक प्रतिध्वनि में परिवर्तन को देख कर एक अनुप्रयुक्त फिल्म के द्रव्यमान और/या यांत्रिक गुणों में ठीक परिवर्तन को मापने के लिए एक विशिष्ट संवेदनशील मंच प्रदान करता है । इस दृष्टिकोण के फायदों में इसकी प्रयोगात्मक बहुमुखी प्रतिभा, प्रयोगात्मक समय लंबाई की एक विस्तृत श्रृंखला में गुणों में परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता, और छोटे नमूना आकारों का उपयोग शामिल है। हम प्रदर्शित करते हैं कि, सेंसर पर जमा परत की मोटाई और कतरनी मॉड्यूलस के आधार पर, हम सामग्री से विभिन्न जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। यहां, इस अवधारणा को विशेष रूप से नमक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में सूजन के दौरान सोने और पॉलीइलेक्ट्रोलाइट परिसरों पर एडीसोबेड कोलेजन की द्रव्यमान और चिपचिपा गणना के परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक मापदंडों को प्रदर्शित करने के लिए शोषण किया जाता है।

Introduction

क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस (क्यूसीएम) अपनी सुनाई देने वाली आवृत्ति की निगरानी के लिए क्वार्ट्ज क्रिस्टल के पीजोइलेक्ट्रिक प्रभाव का लाभ उठाता है, जो सतह के बड़े पैमाने पर पालन करने पर निर्भर है। तकनीक एक एटी कट क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर की सुनाई देती आवृत्ति और बैंडविड्थ की तुलना करती है (आमतौर पर 5 मेगाहर्ट्ज की सीमा में)¹ हवा में या किसी फिल्म के जमाव के बाद सेंसर की आवृत्ति और बैंडविड्थ के लिए तरल पदार्थ। पतली फिल्म गुणों और इंटरफेस का अध्ययन करने के लिए क्यूसीएम का उपयोग करने के लिए कई लाभ हैं, जिनमें द्रव्यमान के लिए उच्च संवेदनशीलता और संभावित रूप से चिपचिपा संपत्ति परिवर्तन (नमूना एकरूपता और मोटाई के आधार पर), सीटू²में अध्ययन करने की क्षमता, और पारंपरिक कतरनी रीलॉजी या गतिशील यांत्रिक विश्लेषण (डीएमए) की तुलना में बहुत कम रीलॉजिकल टाइमस्केल की जांच करने की क्षमता शामिल है। एक छोटी रीओलॉजिकल टाइमस्केल की जांच करने से यह अवलोकन होता है कि इस टाइमस्केल पर प्रतिक्रिया बेहद कम (एमएस)³ और लंबी (वर्ष) अवधि⁴दोनों में कैसे बदलती है। यह क्षमता विभिन्न प्रकार की गतिज प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए लाभदायक है और यह पारंपरिक रिओमेट्रिक तकनीकों का उपयोगी विस्तार भी है^5,6.

क्यूसीएम की उच्च संवेदनशीलता ने अत्यंत छोटे जैव अणुओं की मौलिक बातचीत का अध्ययन करने वाले जैविक अनुप्रयोगों में भी इसका भारी उपयोग किया है। प्रोटीन एसोपशन की जांच के लिए एक अनकोटेड या कार्यात्मक सेंसर सतह का उपयोग किया जा सकता है; आगे भी, एंजाइमों, एंटीबॉडी, और आप्टेमर्स के बीच जटिल बाध्यकारी घटनाओं के माध्यम से बायोसेंसिंग^7,8,9मास में परिवर्तन के आधार पर जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, इस तकनीक का उपयोग वेसिकल्स के परिवर्तन को एक प्लैपर लिपिड बाइलेयर में समझने के लिए किया गया है, जो आवृत्ति और चिपचिपाहट¹⁰में सहसंबंधित परिवर्तनों को देखकर तरल पदार्थ युक्त वेसिकल्स के अवशोषण की दो चरण की प्रक्रिया है। हाल के वर्षों में, क्यूसीएम ने इसके अतिरिक्त वेसिकल्स या नैनोकणों¹¹द्वारा दवा वितरण की निगरानी के लिए एक मजबूत मंच की पेशकश की है । सामग्री इंजीनियरिंग और आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान के चौराहे पर, हम प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, लिपोसोम और कोशिकाओं जैसे सामग्रियों और बायोएक्टिव घटकों के बीच महत्वपूर्ण बातचीत को स्पष्ट करने के लिए QCM का उपयोग कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक बायोमटेरियल मध्यस्थता के लिए प्रोटीन सोखने के लिए डाउनस्ट्रीम सेलुलर प्रतिक्रियाओं जैसे सूजन और अक्सर बायोकॉम्पिटीके सकारात्मक संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है, जबकि अन्य उदाहरणों में रक्त के साथ इंटरफेस करने वाले कोटिंग्स के लिए अतिरिक्त प्रोटीन लगाव^12,13जहाजों में खतरनाक थक्के को प्रेरित कर सकता है। इसलिए QCM को विभिन्न आवश्यकताओं के लिए इष्टतम उम्मीदवारों का चयन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

QCM प्रयोगों को करने के लिए दो सामान्य दृष्टिकोण प्रयोग से अनुरूप डेटा एकत्र करते हैं: पहला दृष्टिकोण आवृत्ति बदलाव और आचरण चोटी के आधे बैंडविड्थ())को रिकॉर्ड करता है। दूसरा दृष्टिकोण, अपव्यय (क्यूसीएम-डी) के साथ क्यूसीएम, आवृत्ति बदलाव और अपव्यय कारक को रिकॉर्ड करता है, जो सीधे समीकरण 1,¹⁴ के माध्यम से आनुपातिक है

(1)

जहां डी अपव्यय कारक है और आवृत्ति है। डी और दोनों ही डैमिंग इफेक्ट से संबंधित हैं फिल्म का सेंसर पर है, जो फिल्म की अकड़न का संकेत देता है । सबस्क्रिप्ट एन आवृत्ति ओवरटोन या हार्मोनिक को दर्शाता है, जो क्वार्ट्ज सेंसर (एन = 1, 3, 5, 7 …) की अजीब सुनाई देती आवृत्तियां हैं। फिल्म के द्रव्यमान और चिपचिपा गुणों को प्राप्त करने के लिए कई हार्मोनिक्स का उपयोग करने वाले मॉडलों की आगे चर्चा जोहान्समैन¹⁴ और पिछले कागजात ों की समीक्षा में शूल समूह^15,16,^17,18से देखी जा सकती है ।

QCM नमूने तैयार करने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि सेंसर सतह पर पतली फिल्म को कैसे लागू किया जाए। कुछ सामान्य तरीकों में^19,20प्रयोग के दौरान सेंसर सतह पर स्पिन कोटिंग, डिप कोटिंग, ड्रॉप कोटिंग, या फिल्म का सोखना शामिल है। क्यूसीएम नमूनों के लिए चार क्षेत्र हैं: सॉर्ब्रे सीमा, चिपचिपा शासन, थोक शासन, और अतिसंपित शासन। पर्याप्त रूप से पतली फिल्मों के लिए, सॉर्ब्रे सीमा लागू होती है, जहां आवृत्ति बदलाव()फिल्म का सतह जन घनत्व प्रदान करता है। सॉर्ब्रे सीमा के भीतर, आवृत्ति बदलाव गूंजते हार्मोनिक, एन के साथ लगभग लिरिकल होते हैं, और डैम्पिंग फैक्टर(डी या ए)में परिवर्तन आम तौर पर छोटे होते हैं। इस व्यवस्था में अतिरिक्त अनुमान लगाए बिना परत के रीलॉजिकल गुणों को विशिष्ट रूप से निर्धारित करने के लिए पर्याप्त जानकारी उपलब्ध नहीं है। इस शासन में डेटा का उपयोग फिल्म की सतह द्रव्यमान घनत्व (या मोटाई की गणना करने के लिए किया जाता है यदि घनत्व को प्राथमिकताओंमें जाना जाता है)। थोक शासन में जहां क्रिस्टल के संपर्क में माध्यम पर्याप्त रूप से मोटी है, इवानसेंट कतरनी लहर पूरी तरह से घटा होने से पहले माध्यम में प्रचारित करती है। यहां, कोईबड़े पैमाने पर जानकारी प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, इस क्षेत्र में, चिपचिपा गुण मज़बूती से ^15,18के संयोजन का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं। थोक शासन में, यदि माध्यम बहुत कठोर है, तो फिल्म सेंसर की गूंज को नम कर देगी, जिससे क्यूसीएम से किसी भी विश्वसनीय डेटा के संग्रह को रोका जा सकेगा । चिपचिपा शासन मध्यवर्ती शासन है जहां फिल्म काफी पतली है कि कतरनी लहर पूरी तरह से फिल्म के माध्यम से प्रचारित करने के साथ-साथ डैमिंग फैक्टर के लिए विश्वसनीय मूल्य हैं । इसके बाद डैमिंग फैक्टर और उसकेद्रव्यमान का इस्तेमाल फिल्म के चिपचिपा गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है । यहां, चिपचिपा गुण घनत्व के उत्पाद और जटिल कतरनी मॉड्यूलस की भयावहता द्वारा दिए जाते हैं। जी*. पी और चरण कोण द्वारा दिए गए = आर्क्टन(जी”/जी’) । जब फिल्मों को सॉर्ब्रे सीमा में तैयार किया जाता है, तो²¹से नीचे दिखाए गए सॉर्ब्रे समीकरण के आधार पर द्रव्यमान प्रति यूनिट क्षेत्र की गणना सीधे की जा सकती है,

(2)

जहां गूंजतीआवृत्ति में परिवर्तन_है, एन ब्याज का ओवरटोन है,₁ सेंसर की गूंज आवृत्ति है, एक फिल्म के प्रति क्षेत्र द्रव्यमान है, और जेड_क्यू क्वार्ट्ज की ध्वनिक बाधा है, जो कट क्वार्ट्ज के लिए जेड_क्यू = 8.84 x 10⁶किलो/ चिपचिपा शासन बहुलक फिल्मों के अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त है, और थोक सीमा चिपचिपा बहुलक²² या प्रोटीन समाधान¹⁶का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है । विभिन्न शासन ों ब्याज की सामग्री के गुणों पर निर्भर करते हैं, पूर्ण चिपचिपा और बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए इष्टतम मोटाई के साथ आम तौर पर फिल्म कठोरता के साथ बढ़ रही है । चित्रा 1 फिल्म के वास्तविक घनत्व, जटिल कतरनी मॉड्यूलस और चरण कोण के संबंध में चार क्षेत्रों का वर्णन करता है, जहां हमने चरण कोण और फिल्म कठोरता के बीच एक विशिष्ट संबंध ग्रहण किया है जिसे इस प्रकार की सामग्रियों के लिए प्रासंगिक दिखाया गया है। व्यावहारिक रुचि की कई फिल्में क्यूसीएम के साथ चिपचिपा गुणों का अध्ययन करने के लिए बहुत मोटी हैं, जैसे कि कुछ बायोफिल्म्स, जहां मोटाई दसियों से सैकड़ों माइक्रोन²³के आदेश पर होती है। इस तरह की मोटी फिल्में आम तौर पर QCM का उपयोग कर अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं, लेकिन बहुत कम आवृत्ति प्रतिध्वनिकर्ताओं (जैसे torsional प्रतिध्वनिकर्ताओं)²³का उपयोग कर मापा जा सकता है, कतरनी लहर फिल्म में आगे प्रचार करने की अनुमति ।

यह निर्धारित करने के लिए कि दिए गए क्यूसीएम नमूने के लिए कौन सा शासन प्रासंगिक है, यह समझना महत्वपूर्ण है कि फिल्म मोटाई(डी)का अनुपात क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर^(15,16,18)के यांत्रिक दोलन की कतरनी तरंगदैर्ध्य में है । आदर्श चिपचिपा शासन डी/0.05 – 0.2¹⁸है, जहां 0.05 से नीचे के मूल्य सॉर्ब्रे सीमा के भीतर हैं और 0.2 से ऊपर के मूल्य थोक शासन से संपर्क करते हैं। डी/एन का अधिक कठोर वर्णन कहीं और प्रदान किया जाता है^15,18,लेकिन यह एक मात्रात्मक पैरामीटर है जो सॉर्ब्रे सीमा और चिपचिपा सीमा को खा रहा है। नीचे उपयोग किए गए विश्लेषण कार्यक्रम इस पैरामीटर को सीधे प्रदान करते हैं।

क्यूसीएम के साथ पतली फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए कुछ अतिरिक्त सीमाएं हैं। Sauerbrey और चिपचिपा गणना मान फिल्म दोनों फिल्म मोटाई भर में सजातीय है और बाद में QCM के इलेक्ट्रोड सतह के पार । हालांकि इस धारणा से उन फिल्मों का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है जिनमें रिक्तियां या भराव मौजूद हैं, लेकिन ग्राफ्ट किए गए नैनोकणों^सेमिलकर फिल्मों में कुछ क्यूसीएम जांच हुई है । यदि विषमताएं समग्र फिल्म मोटाई की तुलना में छोटी हैं, तो समग्र प्रणाली के विश्वसनीय चिपचिपा गुण अभी भी प्राप्त किए जा सकते हैं। अधिक विषम प्रणालियों के लिए, चिपचिपा विश्लेषण से प्राप्त मूल्यों को हमेशा बड़ी सावधानी से देखा जाना चाहिए। आदर्श रूप से, अज्ञात विषमता वाले सिस्टम से प्राप्त परिणामों को उन प्रणालियों के खिलाफ मान्य किया जाना चाहिए जिन्हें सजातीय माना जाता है। इस पेपर में वर्णित उदाहरण प्रणाली में हमने यही दृष्टिकोण अपनाया है ।

एक महत्वपूर्ण बात जो हम इस पेपर में दिखाते हैं, वह है फ्रीक्वेंसी डोमेन (जहां रिपोर्ट की गई है) और समय डोमेन प्रयोगों (जहां डी की रिपोर्ट की गई है) में किए गए क्यूसीएम मापन के बीच सटीक पत्राचार है। दो अलग-अलग क्यूसीएम प्रयोगों, एक बार डोमेन और एक आवृत्ति डोमेन के परिणाम वर्णित हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक अलग लेकिन अवधारणापूर्ण रूप से संबंधित मॉडल प्रणाली शामिल है। पहली प्रणाली एक समय डोमेन (क्यूसीएम-डी) माप के दौरान समय के साथ प्रतिनिधि बाध्यकारी काइनेटिक्स और सोखने के संतुलन को समझाने के लिए सेंसर के लिए कोलेजन लगाव का एक सरल उदाहरण है। कोलेजन शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है, जो बाध्यकारी व्यवहार और आकृति विज्ञान की अपनी बहुमुखी प्रतिभा के लिए जाना जाता है। यहां उपयोग किए जाने वाले कोलेजन समाधान को एसोप्पशन⁹को प्रेरित करने के लिए सेंसर की सोने की सतह के अतिरिक्त कार्यात्मककरण की आवश्यकता नहीं होती है। दूसरी प्रायोगिक प्रणाली एक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स (पीईसी) है जो एनियोनिक पॉलीस्टीरिन सल्फोनेट (पीएसएस) और सीनिक पॉली (डायलिलीडिमेथिलम्मोनियम) (PDADMA) से बना है जो सडन एट अल²²के समान फैशन में तैयार किया गया है। ये सामग्रियां प्रफुल्लित होती हैं और नमक (इस मामले में केबीआर) समाधानों में नरम हो जाती हैं, जो आवृत्ति डोमेन दृष्टिकोण (क्यूसीएम-जेड) का उपयोग करके बहुलक यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए एक सरल मंच प्रदान करती हैं। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए, माप को तैयार करने, लेने और विश्लेषण करने की प्रक्रिया चित्रा 2में दिखाई गई है। योजनाबद्ध तरीके से पता चलता है कि क्यूसीएम-जेड और क्यूसीएम-डी दृष्टिकोण के बीच मुख्य अंतर डेटा संग्रह चरण और प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले इंस्ट्रूमेंटेशन में है। सभी उल्लिखित नमूना तैयारी तकनीक दोनों दृष्टिकोणों के साथ संगत हैं, और प्रत्येक दृष्टिकोण चित्रा 1में चित्रित तीन क्षेत्रों में नमूनों का विश्लेषण कर सकता है।

हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि नमूनों की तैयारी, चाहे सेंसर कोटिंग से पहले या एक माप के दौरान, एक प्रणाली के चिपचिपा गुणों को निकालने की क्षमता तय करता है । किसी प्रयोग के शुरुआती दौर को उचित रूप से डिजाइन करके, हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि विश्लेषण चरण के दौरान हम क्या जानकारी सटीक रूप से इकट्ठा कर सकते हैं।

Protocol

क्यूसीएम-डी कोलेजन एसोप्पशन 1. नमूना तैयारी और सेंसर पूर्व सफाई 0.1 एम एसीटेट बफर के 20 मीटर तैयार करें, पीएच = 5.6 प्राप्त करने के लिए आवश्यक एचसीएल और नाओएच के साथ पीएच को समायोजित करें।</l…

Representative Results

प्रोटीन सोखने के दौरान समय के साथ आवृत्ति में परिवर्तन चित्रा 3ए-बीमें दिखाए गए एक विशिष्ट वक्र और पठार का प्रदर्शन करते हैं। नंगे सेंसर सतह भर में 1x पीबीएस के प्रारंभिक बफर वॉश आवृत्त…

Discussion

कोलेजन सोखने के परिणाम सॉर्ब्रे और चिपचिपा शासनों तक फैले हुए हैं। इसी हार्मोनिक संख्या के लिए सामान्यीकृत आवृत्ति बदलाव की साजिश रचकर, हम देखते हैं कि सॉर्ब्रे सीमा माप के लगभग पहले 2 एच के लिए सही रखत…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling