Preparação de amostras em medições de microequilíbrio de cristal de quartzo de adsorção de proteínas e mecânica de polímeros

Summary

O microequilíbrio de cristal de quartzo pode fornecer propriedades precisas de massa e viscoelásticas para filmes na faixa de mícrons ou submicron, o que é relevante para investigações em sensoriamento biomédico e ambiental, revestimentos e ciência de polímeros. A espessura da amostra influencia quais informações podem ser obtidas a partir do material em contato com o sensor.

Abstract

Neste estudo, apresentamos vários exemplos de como a preparação fina do filme para experimentos de microequilíbrio de cristal de quartzo informa a modelagem adequada dos dados e determina quais propriedades do filme podem ser quantificadas. O microequilíbrio de cristal de quartzo oferece uma plataforma exclusivamente sensível para medir mudanças finas em propriedades de massa e/ou mecânicas de um filme aplicado, observando as mudanças na ressonância mecânica de um cristal de quartzo oscilando em alta freqüência. As vantagens dessa abordagem incluem sua versatilidade experimental, capacidade de estudar mudanças nas propriedades ao longo de uma ampla gama de comprimentos de tempo experimentais e o uso de pequenos tamanhos de amostra. Demonstramos que, com base na espessura e no modulus de cisalhamento da camada depositada no sensor, podemos adquirir informações diferentes do material. Aqui, este conceito é especificamente explorado para exibir parâmetros experimentais, resultando em cálculos em massa e viscoelásticos de colágeno adsorlado em complexos de ouro e polieletrólitos durante o inchaço em função da concentração de sal.

Introduction

O microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM) aproveita o efeito piezoelétrico de um cristal de quartzo para monitorar sua frequência ressonante, que depende da massa aderida à superfície. A técnica compara a freqüência ressonante e largura de banda de um sensor de cristal de quartzo at corte (normalmente na faixa de 5 MHz)¹ no ar ou um fluido para a freqüência e largura de banda do sensor após a deposição de um filme. Existem vários benefícios para o uso do QCM para estudar propriedades e interfaces de película fina, incluindo a alta sensibilidade à massa e potencialmente a mudanças de propriedade viscoelásticas (dependendo da uniformidade e espessura da amostra), a capacidade de realizar estudos in situ^2,e a capacidade de sondar uma escala de tempo reológica muito mais curta do que a reologia tradicional da tesoura ou análise dinâmica mecânica (DMA). Sondar um curto calendário reológico permite a observação de como a resposta neste período de tempo muda tanto ao longo de durações extremamente curtas (ms)³ e longas (anos)⁴. Esta capacidade é benéfica para o estudo de uma variedade de processos cinéticos e também é uma extensão útil das técnicas rheométricas tradicionais^5,6.

A alta sensibilidade do QCM também levou ao seu uso pesado em aplicações biológicas estudando as interações fundamentais de biomoléculas extremamente pequenas. Uma superfície de sensor não revestida ou funcionalizada pode ser usada para investigar a adsorção de proteínas; ainda mais, biosensoriar através de eventos de ligação complexos entre enzimas, anticorpos e aptamers pode ser examinado com base em mudanças na massa^7,8,9. Por exemplo, a técnica tem sido usada para entender a transformação das vesículas em um bilayer lipídico planar como um processo de duas fases de adsorção de vesículas contendo fluidos para uma estrutura rígida, observando mudanças correlacionantes na frequência e viscoelasticidade¹⁰. Nos últimos anos, o QCM também ofereceu uma plataforma robusta para monitorar a entrega de drogas por vesículas ou nanopartículas¹¹. Na interseção da engenharia de materiais e da biologia molecular e celular, podemos usar o QCM para elucidar as principais interações entre materiais e componentes bioativos, como proteínas, ácidos nucleicos, lipossomos e células. Por exemplo, adsorção de proteína a um biomaterial medeia respostas celulares a jusante, como inflamação e é frequentemente usada como um indicador positivo de biocompatibilidade, enquanto em outros casos o apego de proteína extracelular a revestimentos que a interface com o sangue pode induzir coagulação perigosa nos vasos^12,13. O QCM pode, portanto, ser usado como uma ferramenta para selecionar candidatos ideal para diferentes necessidades.

Duas abordagens comuns para a realização de experimentos de QCM coletam dados análogos do experimento: a primeira abordagem registra a mudança de frequência e a meia largura de banda(Γ)do pico de condução. A segunda abordagem, O QCM com dissipação (QCM-D), registra a mudança de frequência e o fator de dissipação, que é diretamente proporcional ao Γ por meio da equação 1,¹⁴

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onde D é o fator de dissipação e dilema é a freqüência. Tanto D quanto Γ estão relacionados ao efeito de amortecimento que o filme tem no sensor, o que dá uma indicação da rigidez do filme. O subscript n denota o tom de freqüência ou harmônico, que são as freqüências ressonantes ímpares do sensor de quartzo (n = 1, 3, 5, 7…). Uma discussão mais adicional dos modelos que usam harmônicos múltiplos para obter as propriedades maciças e viscoelastic de uma película pode ser encontrada em uma revisão por Johannsmann¹⁴ e em papéis precedentes do grupo de Shull^15,16,17,18.

Uma consideração fundamental para a preparação de amostras QCM é como aplicar a película fina na superfície do sensor. Alguns métodos comuns incluem revestimento de rotação, revestimento de mergulho, revestimento de gota ou adsorção do filme na superfície do sensor durante o experimento^19,20. Há quatro regiões para amostras de QCM: o limite de Sauerbrey, o regime viscoelastic, o regime maioria, e o regime overdamped. Para filmes suficientemente finos, o limite sauerbrey se aplica, onde a mudança de freqüência(δ)fornece a densidade de massa superficial do filme. Dentro do limite sauerbrey, as escalas de deslocamento de freqüência linearmente com o harmônico ressonante, n, e as mudanças no fator de amortecimento (D ou Γ) são geralmente pequenas. Neste regime, não há informações suficientes para determinar exclusivamente as propriedades reológicas da camada sem fazer suposições adicionais. Os dados deste regime são usados para calcular a densidade de massa superficial (ou espessura se a densidade é conhecida a priori) do filme. No regime a granel, onde o meio em contato com o cristal é suficientemente grosso, a onda de cisalhamento evanescente se propaga para o meio antes de ser completamente atenuada. Aqui, nenhuma informação de massa pode ser obtida usando δ. No entanto, nesta região, as propriedades viscoelásticas são determinadas de forma confiável usando a combinação de Δdecidida e ΔΓ ^15,18. No regime a granel, se o meio for muito rígido, o filme vai amortecer a ressonância do sensor, impedindo a coleta de quaisquer dados confiáveis do QCM. O regime viscoelástico é o regime intermediário onde o filme é fino o suficiente para ter a onda de cisalhamento totalmente propagar através do filme, bem como têm valores confiáveis para o fator de amortecimento. O fator de amortecimento e δpodem então ser usados para determinar as propriedades viscoelásticas do filme, bem como a sua massa. Aqui, as propriedades viscoelásticas são dadas pelo produto da densidade e da magnitude do complexo modulus cisalhamento | G*| G *| p e o ângulo de fase dado por Φ = arctan (G” / G’). Quando os filmes são preparados no limite de Sauerbrey, a massa por unidade pode ser calculada diretamente com base na equação sauerbrey mostrada abaixo de²¹,

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onde Δ_n é a mudança na frequência ressonante, n é o tom de interesse, hidrobordo₁ é a frequência ressonante do sensor, Δm/A é a massa por área do filme, e Z _q é a impedância acústica de quartzo, que para o quartzo cortado at é Z _q = 8,84 x 10⁶kg / m²s. O regime viscoelástico é mais apropriado para o estudo de filmes de polímeros, e o limite de massa é útil para estudar polímero viscoso²² ou soluções proteicas^16. Os diferentes regimes dependem das propriedades do material de interesse, com a espessura ideal para caracterização viscoelástica e em massa geralmente aumentando com a rigidez do filme. A Figura 1 descreve as quatro regiões com relação à densidade areal do filme, modulus cisalhamento complexo e ângulo de fase, onde assumimos uma relação específica entre o ângulo de fase e a rigidez do filme que se mostrou relevante para materiais deste tipo. Muitos filmes de interesse prático são muito grossos para estudar as propriedades viscoelásticas com QCM, como certos biofilmes, onde as espessuras estão na ordem de dezenas a centenas de mícrons²³. Tais filmes grossos geralmente não são apropriados para estudar usando o QCM, mas podem ser medidos usando ressonadores de frequência muito mais baixa (como ressonadores torsionais)^23,permitindo que a onda de cisalhamento se propague ainda mais no filme.

Para determinar qual regime é relevante para uma determinada amostra de QCM, é importante entender o parâmetro d/λ _n, que é a razão da espessura do filme(d)para o comprimento de onda de cisalhamento da oscilação mecânica do sensor de cristal de quartzo (λ_n)^15,16,18. O regime viscoelástico ideal é d / λ_n = 0,05 – 0,2¹⁸, onde os valores abaixo de 0,05 estão dentro do limite sauerbrey e valores acima de 0,2 abordagem do regime a granel. Uma descrição mais rigorosa de d / λ_n é fornecido em outros lugares^15,18, mas é um parâmetro quantitativo delineando o limite Sauerbrey e o limite viscoelástico. Os programas de análise usados abaixo fornecem esse parâmetro diretamente.

Existem algumas limitações adicionais para analisar filmes finos com o QCM. Os cálculos sauerbrey e viscoelásticos assumem que o filme é homogêneo tanto ao longo da espessura do filme quanto lateralmente na superfície do eletrodo do QCM. Embora essa suposição torne difícil estudar filmes que tenham vazios ou enchimentos presentes, houve algumas investigações da QCM em filmes que consistem em nanopartículas enxertadas⁶. Se as heterogeneidades são pequenas em comparação com a espessura geral do filme, propriedades viscoelásticas confiáveis do sistema composto ainda podem ser obtidas. Para sistemas mais heterogêneos, os valores obtidos a partir de uma análise viscoelástica devem ser sempre vistos com grande cautela. Idealmente, os resultados obtidos a partir de sistemas com heterogeneidade desconhecida devem ser validados contra sistemas que são conhecidos por serem homogêneos. Esta é a abordagem que tomamos no sistema de exemplo descrito neste artigo.

Um ponto importante que ilustramos neste artigo é a correspondência exata entre as medições de QCM feitas no domínio de frequência (onde o Γ é relatado) e os experimentos de domínio do tempo (onde D é relatado). Resultados de dois experimentos diferentes de QCM, domínio de uma vez e um domínio de frequência, são descritos, cada um envolvendo um sistema de modelo diferente, mas conceitualmente relacionado. O primeiro sistema é um exemplo simples de apego de colágeno ao sensor para ilustrar cinética sem ligarepresentativa e equilíbrio de adsorção ao longo do tempo durante uma medição de domínio de tempo (QCM-D). O colágeno é a proteína mais abundante no corpo, conhecida por sua versatilidade de comportamentos de ligação e morfologia. A solução de colágeno usada aqui não requer funcionalização adicional da superfície de ouro do sensor para induzir adsorção^9. O segundo sistema experimental é um complexo de polieletrólito (PEC) composto por sulfona de poliestireno aniônico (PSS) e poli cationic (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparado da mesma forma que Sadman et al.²². Estes materiais incham e tornam-se macios em soluções de sal (KBr neste caso), oferecendo uma plataforma simples para estudar a mecânica de polímeros usando uma abordagem de domínio de frequência (QCM-Z). Para cada protocolo, o processo de preparação, tomada e análise de uma medição é mostrado na Figura 2. O esquema mostra que a principal diferença entre as abordagens QCM-Z e QCM-D está na etapa de coleta de dados e na instrumentação utilizada no experimento. Todas as técnicas de preparação de amostras mencionadas são compatíveis com ambas as abordagens, e cada abordagem pode analisar amostras nas três regiões descritas na Figura 1.

Nossos dados demonstram que a preparação das amostras, seja pelo revestimento do sensor antes ou durante uma medição, dita a capacidade de extrair as propriedades viscoelásticas de um sistema. Ao projetar os estágios iniciais de um experimento adequadamente, podemos determinar quais informações podemos coletar com precisão durante a etapa de análise.

Protocol

Adsorção de colágeno QCM-D 1. Preparação da amostra e pré-limpeza do sensor Prepare 20 mL de 0,1 M tampão de acetato, ajustando o pH com HCl e NaOH conforme necessário para alcançar pH = 5,6. Adicione a solução de colágeno da cauda de rato aos 20 mL de tampão de acetato em condições estéreis a uma concentração final de 10 μg/mL. Limpe o sensor de quartzo revestido a ouro para remover material orgânico e biológico<sup class="xr…

Representative Results

As mudanças de frequência com o tempo durante a adsorção de proteínas apresentam uma curva característica e platô mostrado na Figura 3A-B. A lavagem tampão inicial de 1x PBS através da superfície de sensato induz apenas mudanças insignificantes na frequência, oferecendo uma linha de base constante para atuar como referência para pontos de dados futuros. A introdução da solução de colágeno faz com que a adsorção de proteína saqueie, observada como uma dim…

Discussion

Os resultados da adsorção de colágeno abrangem os regimes sauerbrey e viscoelásticos. Ao traçar as mudanças de frequência normalizadas para o número harmônico correspondente, observamos que o limite de Sauerbrey é válido para aproximadamente os primeiros 2 h da medição. Com o aumento da adesão em massa ao sensor, no entanto, as mudanças de frequência normalizadas para o terceiro e quinto harmônicos começam a desviar-se um do outro(t > 2 h), indicando uma capacidade de determinar propriedades vi…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling