En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing
Summary
Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.
Abstract
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial de la mucosa. Recientemente demostramos que las células T reguladoras intestinales (Treg) son una terapia prometedora para la EII. En consecuencia, este artículo presenta un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir concentraciones localmente altas de dos moléculas de novo, vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA basándose en hallazgos anteriores que muestran que 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabecera P3 e interleucina-10) y que la AR puede estimular la expresión de receptores intestinales en células T. Para generar estas células dendríticas diseñadas, utilizamos un vector lentiviral para transducir las células dendríticas para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1o-hidroxilasa, que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2, que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA. Este protocolo se puede utilizar para la investigación futura de células Treg intestinales in vivo.
Introduction
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial mucosa1,2. Por esta razón, actualmente disponibles medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus sitios) inhiben las funciones de los mediadores inflamatorios o bloquean la localización de células inmunitarias en el intestino. Sin embargo, los mediadores inflamatorios y las células inmunitarias que están dirigidas también son necesarios para las defensas inmunitarias. Como resultado, los inhibidores del mediador inflamatorio comprometen la defensa inmune sistémica y los bloqueadores de homing de células inmunitarias debilitan la defensa inmune intestinal, lo que puede conducir a consecuencias graves3,4. Además, los bloqueadores de homing de células inmunitarias también pueden bloquear la homing de células T reguladoras (Treg) en el intestino y por lo tanto pueden empeorar la tolerancia inmunitaria intestinal ya comprometida en pacientes con EII. Además, el bloqueo de la célula de Treg homing en el intestino también puede conducir a la supresión inmune sistémica debido a la acumulación de células Treg en la sangre5. Por último, los inhibidores y bloqueadores funcionan de forma transitoria y, por lo que, requieren administraciones frecuentes. La administración frecuente de estos inhibidores y bloqueadores puede exacerbar aún más los efectos secundarios adversos.
Recientemente, propusimos una estrategia novedosa que potencialmente puede mitigar o incluso eliminar los efectos secundarios asociados con los fármacos actuales para el tratamiento de la EII6. Esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6. La razón de esta estrategia es que las células Treg intestinales específicamente hogar del intestino y por lo tanto no comprometerá las defensas inmunitarias sistémicas. Además, dado que las células Treg pueden potencialmente formar memoria7,8, las células Treg intestinales pueden potencialmente proporcionar un control estable de la inflamación intestinal crónica en pacientes con EII y, por lo tanto, el tratamiento no debe ser necesario administrar con tanta frecuencia. Además, dado que esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales in vivo, no tiene la preocupación de la inestabilidad in vivo en un entorno altamente proinflamatorio que se asocia con la transferencia adoptiva de células Treg generadas in vitro9,10. En este sentido, las células Treg generadas in vitro son una de las estrategias propuestas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes11,12,13 y rechazo de trasplante14,15. Finalmente, en esta estrategia, las células dendríticas (CC) están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de dos moléculas de novo: vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA porque 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabezal de horquilla P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 y que RA puede estimular la expresión de receptores de homing intestinal en las células T18. Debido a que tanto 1,25(OH)2D como RA también pueden tolerizar los CC28,29,raquemos por ello que los CC de ingeniería se mantendrán establemente en un estado tolerogénico in vivo y, por lo tanto, eludan las preocupaciones de inestabilidad in vivo asociadas con los CC tolerogénicos generados in vitro (TolDCs)19,20,21. En este sentido, los TolDC son también una de las estrategias propuestas para el aumento in vivo de las funciones celulares treg19,20,21. Para apoyar nuestro razonamiento, hemos demostrado que los controladores de tecnología de desarrollo, tras la entrega in vivo, pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6.
Una ventaja adicional de nuestra estrategia propuesta es que 1,25(OH)2D también tiene otras funciones que potencialmente pueden beneficiar a los pacientes con EII. Estas otras funciones incluyen la capacidad de 1,25(OH)2D para estimular la secreción de antimicrobianos22 y para suprimir la carcinogénesis23. Las infecciones y los cánceres se asocian con frecuencia con la EII24,25.
Para generar los CC que pueden producir concentraciones localmente altas de 1,25(OH)2D y RA de novo, utilizamos un vector lentiviral para diseñar dCs para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D-hidroxilasa (1o-hidroxilasa), que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 (ALDH1a2) que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2 (RALDH2), que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA6.
Debido a que el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal es potencialmente importante en el tratamiento de la EII, en el siguiente protocolo detallaremos los procedimientos para la generación de los DC subexpresantes 1–hidroxilasa-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que se puede utilizar para la futura investigación de células Treg intestinales in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo describimos el uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos. Nuestros datos han demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden sintetizar concentraciones localmente altas de novo de 1,25(OH)2D y RA in vitro en presencia de sustratos correspondientes (es decir, 25[OH]D y retinol, respectivamente). Debido a que las concentraciones sanguíneas suficientes de 25(OH)D y retinol se pueden lograr fácilmente a través de sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación Médica Revisado por Pares bajo el Premio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por las Becas de Innovación en Investigación del Departamento de Medicina de la Universidad Loma Linda (681207-2967 [XT y GG], 681205-2967 [XT] y 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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