यहां हम आंत-होमिंग नियामक टी सेल इंडक्शन के वीवो वृद्धि में एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं को स्थानीय रूप से सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सिविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए) डी नोवो की उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है।
भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट (आंत) में एक भड़काऊ पुरानी बीमारी है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 1.4 मिलियन आईबीडी रोगी हैं। आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि आंत बैक्टीरिया के लिए एक डिसविनियमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोग शुरू करती है और म्यूकोसल एपिथेलियल बाधा को बाधित करती है। हम हाल ही में बताते है कि आंत-homing नियामक टी (Treg) कोशिकाओं IBD के लिए एक आशाजनक चिकित्सा कर रहे हैं । तदनुसार, यह लेख आंत-होमिंग ट्रेग सेल इंडक्शन के वीवो वृद्धि में एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, डेंड्रिटिक कोशिकाओं को दो अणुओं डी नोवो, सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए) की स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। हमने पिछले निष्कर्षों के आधार पर 1,25 (ओह)2डी और आरए को चुना जो दिखारहा है कि 1,25 (ओह)2डी नियामक अणुओं (जैसे, फोर्हेड बॉक्स पी 3 और इंटरल्यूकिन-10) की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है और आरए टी कोशिकाओं में आंत-होमिंग रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को उत्तेजित कर सकता है। इस तरह के इंजीनियर डेंड्रिटिक कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, हम दो जीन को ओवर्ड्यू करने के लिए डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं को पार करने के लिए एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करते हैं। एक जीन साइटोक्रोम P450 परिवार 27 उपपरिवार बी सदस्य 1 है कि 25 हाइड्रोक्सीविटामिन डी 1α-हाइड्रोक्सीलेस, जो शारीरिक रूप से 1,25 (ओह)2डी के संश्लेषण उत्प्रेरक एनकोड है । दूसरा जीन एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार के सदस्य ए 2 है जो रेटिनाल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 2 को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से आरए के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की भविष्य की जांच के लिए किया जा सकता है।
भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट (आंत) में एक भड़काऊ पुरानी बीमारी है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 1.4 मिलियन आईबीडी रोगी हैं। आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि आंत के बैक्टीरिया के प्रति एक डिसरेक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोग शुरू करती है और म्यूकोसल एपिथेलियल बैरियर1,2को बाधित करती है । इस कारण से, वर्तमान में उपलब्ध अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) – अनुमोदित दवाएं भड़काऊ मध्यस्थों के कार्यों को रोकती हैं या प्रतिरक्षा कोशिकाओं की होमिंग को आंत में अवरुद्ध करती हैं। हालांकि, लक्षित किए गए भड़काऊ मध्यस्थ और प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्रतिरक्षा सुरक्षा के लिए भी आवश्यक हैं। नतीजतन, भड़काऊ मध्यस्थ अवरोधक प्रणालीगत प्रतिरक्षा रक्षा से समझौता करते हैं और प्रतिरक्षा सेल होमिंग ब्लॉकर्स आंत प्रतिरक्षा रक्षा को कमजोर करते हैं, जिनमें से दोनों गंभीर परिणाम3,4का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा सेल होमिंग ब्लॉकर्स भी नियामक टी (Treg) कोशिकाओं के पेट में होमिंग ब्लॉक कर सकते है और इसलिए IBD रोगियों में पहले से ही समझौता आंत प्रतिरक्षा सहिष्णुता खराब कर सकते हैं । इसके अलावा, पेट में ट्रेग सेल होमिंग को अवरुद्ध करने से रक्त5में ट्रेग कोशिकाओं के संचय के कारण प्रणालीगत प्रतिरक्षा दमन भी हो सकता है। अंत में, अवरोधक और ब्लॉकर्स क्षणिक रूप से कार्य करते हैं और इस तरह, लगातार प्रशासन की आवश्यकता होती है। इन अवरोधकों और ब्लॉकर्स का लगातार प्रशासन अप्रिय दुष्प्रभावों को और बढ़ा सकता है।
हाल ही में, हमने एक उपन्यास रणनीति का प्रस्ताव किया जो आईबीडी उपचार6के लिए वर्तमान दवाओं से जुड़े दुष्प्रभावों को संभावित रूप से कम या खत्म कर सकती है। यह रणनीति पेरिफेरल लिम्फोइड ऊतकों6में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने को बढ़ाती है। इस रणनीति का तर्क यह है कि आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाएं विशेष रूप से आंत के घर हैं और इसलिए प्रणालीगत प्रतिरक्षा सुरक्षा से समझौता नहीं करेंगे। इसके अलावा, चूंकि रेग कोशिकाएं संभावित रूप से स्मृति7,8,आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाएं संभावित रूप से आईबीडी रोगियों में पुरानी आंत सूजन का स्थिर नियंत्रण प्रदान कर सकती हैं और इस प्रकार, उपचार को अक्सर प्रशासित करने की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए। इसके अलावा, चूंकि यह रणनीति वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि करती है, इसलिए इसमें एक अत्यधिक भड़काऊ वातावरण में वीवो अस्थिरता की चिंता नहीं है जो इन विट्रो जनित ट्रेग कोशिकाओं9,10के दत्तक हस्तांतरण से जुड़ा हुआ है। इस संबंध में, इन विट्रो जनित ट्रेग कोशिकाएं ऑटोइम्यून रोगों11,12,13 और प्रत्यारोपण अस्वीकृति 14,15के उपचार के लिए प्रस्तावित रणनीतियों में से एक हैं। अंत में, इस रणनीति में, डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को दो अणुओं डी नोवो की स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है: सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए)। हमने 1,25 (ओह)2डी और आरए को चुना क्योंकि 1,25 (ओह)2डी नियामक अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है (उदाहरण के लिए, फोर्कहेड बॉक्स पी 3 [foxp3] और interleukin-10 [आईएल-10])16,17 और आरए टी सेल18में आंत-होमिंग रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को उत्तेजित कर सकता है । क्योंकि 1,25 (OH)2डी और आरए दोनों ही डीसी28, 29को भी टॉलराइज कर सकते हैं, हमारा कारण है कि इंजीनियर डीसी को वीवो में एक सहरोगी स्थिति में बनाए रखा जाएगा और इसलिए वीवो अस्थिरता चिंताओं को दरकिनार कर दिया जाएगा जो इन विट्रो जनित टॉरोजेनिक डीसी (टॉलडीसी)19,20,21से जुड़े हुए हैं । इस संबंध में, टोलडीसी भी ट्रेग सेलकार्यों 19,20,21के वीवो संवर्धन में प्रस्तावित रणनीतियों में से एक हैं। हमारे तर्कों का समर्थन करने के लिए, हमने दिखाया है कि वीवो डिलीवरी में इंजीनियर डीसी, पेरिफेरल लिम्फोइड ऊतकों6में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने को बढ़ा सकते हैं।
हमारी प्रस्तावित रणनीति का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि 1,25 (ओह)2डी में अन्य कार्य भी हैं जो आईबीडी रोगियों को संभावित रूप से लाभान्वित कर सकते हैं। इन अन्य कार्यों में एंटीमाइक्रोबियल्स22 के स्राव को प्रोत्साहित करने और कार्सिनोजेनेसिस23को दबाने के लिए 1,25 (ओह)2डी की क्षमता शामिल है। संक्रमण और कैंसर अक्सर आईबीडी24,25से जुड़े होते हैं .
डीसी है कि दोनों 1,25 (OH)2डी और RA de novo के स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन कर सकते है उत्पंन करने के लिए, हम दो जीन को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए डीसी इंजीनियर करने के लिए एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करें । एक जीन साइटोक्रोम P450 परिवार 27 उपपरिवार बी सदस्य 1 (CYP27B1) है जो 25-हाइड्रोक्सीविटामिन डी 1α-हाइड्रोक्सीलेस (1α-हाइड्रोक्सीलास) को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से 1,25 (ओह)2डी के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है। दूसरा जीन एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार के सदस्य A2 (ALDH1a2) है जो रेटिनाल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 2 (RALDH2) को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से आरए6के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है।
क्योंकि आंत के वीवो वृद्धि में-homing Treg सेल प्रेरण आईबीडी के उपचार में संभावित रूप से महत्वपूर्ण है, निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम 1α-hydroxylase-RALDH2-overexpressing डीसी (डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं) की पीढ़ी के लिए प्रक्रियाओं का विस्तार करेंगे कि वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की भविष्य की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस लेख में हम परिधीय लिम्फोड ऊतकों में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि करने के लिए डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन करते हैं। हमारे डेटा से पता चला है कि डीसी-CYP-ALDH कोशि?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को पुरस्कार संख्या के तहत सहकर्मी समीक्षा चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य मामलों के लिए रक्षा के सहायक सचिव के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था । W81XWH-15-1-0240 (XT) । राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष, और सिफारिशों लेखक के उन रहे है और जरूरी रक्षा विभाग द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । इस काम को लोमा लिंडा विश्वविद्यालय में चिकित्सा विभाग (681207-2967 [XT और GG], 681205-2967 [XT], और ३२५४९१ [डीजेबी]) से अनुसंधान नवाचार अनुदान द्वारा भी आंशिक रूप से समर्थित किया गया था ।
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |